創(chuàng)新藥物丹參素鈉的體內(nèi)分析及其代謝研究.pdf

1、藥物代謝動力學(xué)旨在通過測定生物樣本中的藥物或者代謝產(chǎn)物的濃度，定量描述藥物進(jìn)入體內(nèi)以后的吸收、分布、代謝、排泄過程，進(jìn)而闡明藥物的藥效或者毒性，為新藥研究的代謝篩選和臨床用藥的療效評價提供重要依據(jù)。丹參素為從唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bunge的干燥根中提取出的單體化合物，具有明顯的藥理活性。作為丹參的主要活性成分之一，有必要對丹參素進(jìn)行藥代動力學(xué)研究，探討其體內(nèi)過程。本文建立的LC-MS/MS法測定血漿、尿

2、液、膽汁等多種生物樣本中的丹參素鈉濃度，滿足臨床前藥代動力學(xué)研究對高靈敏度、高選擇性檢測的技術(shù)要求。此外，本文還進(jìn)行了丹參素鈉的體內(nèi)、體外代謝研究，初步建立了體外代謝篩選研究平臺，為進(jìn)一步開展臨床用藥及劑型開發(fā)提供參考依據(jù)。
　　 一、生物樣品中丹參素鈉定量分析方法的建立與確證
　　 在臨床前藥代動力學(xué)研究中，定量分析方法的建立與確證占有舉足輕重的地位，只有建立可靠、專一、靈敏、快速的生物樣品分析方法，才能保證藥代動力學(xué)

3、研究的順利進(jìn)行。本文采用高靈敏度的LC-MS/MS方法檢測生物樣品中丹參素鈉的濃度，生物樣品以鹽酸酸化后用乙酸乙酯提取其中的丹參素鈉。色譜分析采用迪馬Diamonsil C-18，5μm，200×4.6mm，柱溫25℃；流動相組成為甲醇：水=80:20（含0.01‰甲酸），采用等梯度洗脫方式，流速0.80mL/min，3:2分流入質(zhì)譜的流速為0.32mL/min，進(jìn)樣量20μl。質(zhì)譜檢測采用ESI離子源、負(fù)離子檢測模式，選擇MRM工作方

4、式進(jìn)行質(zhì)譜分析。經(jīng)完整的方法學(xué)確證，所有測定生物樣品的線性、準(zhǔn)確度、精密度、回收率、基質(zhì)效應(yīng)、稀釋效應(yīng)、穩(wěn)定性等均滿足生物樣品的定量分析要求。該方法成功用于SD大鼠的藥代動力學(xué)研究及尿液和膽汁的排泄研究。
　　 二、丹參素鈉在SD大鼠體內(nèi)的臨床前藥代動力學(xué)研究
　　 本試驗設(shè)計SD大鼠單劑量尾靜脈注射給藥丹參素鈉15mg/kg、30mg/kg、60mg/kg三個劑量組進(jìn)行藥代動力學(xué)研究。采用LC-MS/MS測定方法分別測

5、定了給藥后不同時間的體內(nèi)丹參素鈉血藥濃度。按血漿樣品預(yù)處理操作，測得數(shù)據(jù)代入相應(yīng)樣品隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線中求得含量。經(jīng)非房室模型法估算藥代動力學(xué)參數(shù)。結(jié)果表明，大鼠單劑量靜注給藥丹參素鈉15mg/kg、30mg/kg、60mg/kg三個劑量組藥代動力學(xué)藥時曲線末端相消除半衰期（t1/2）分別為2.73h、2.37h、1.95h；AUC0～∞分別為15.29μg·h/mL、34.58μg·h/mL和58.49μg·h/mL，AUC與給藥劑量基本呈

6、正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r2為0.9836。
　　 SD大鼠單劑量尾靜脈注射給藥丹參素鈉30mg/kg后，于給藥后收集0～96h的尿液，按尿液樣品預(yù)處理操作，測得數(shù)據(jù)代入相應(yīng)樣品隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線中求得含量。結(jié)果表明，丹參素鈉在SD大鼠體內(nèi)主要經(jīng)尿液排泄，96h藥物累積排泄量為46.99％。SD大鼠單劑量尾靜脈注射給藥丹參素鈉30mg/kg后，于給藥后0～24h取其膽汁，按膽汁樣品預(yù)處理操作，測得數(shù)據(jù)代入膽汁樣品隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線中求得含量。結(jié)果表

7、明，丹參素鈉在SD大鼠體內(nèi)經(jīng)膽汁排泄量少，24h內(nèi)膽汁累積排泄量為給藥劑量的0.82％。綜上所述，丹參素鈉在SD大鼠體內(nèi)主要以原型藥的形式直接由尿排出體外。
　　 三、丹參素鈉體內(nèi)外代謝的初步研究
　　 丹參素鈉給藥后大鼠膽汁和尿液樣品的分析結(jié)果顯示，其進(jìn)入體內(nèi)后，主要發(fā)生Ⅱ相代謝反應(yīng)，主要代謝物為：甲基化丹參素[M-H+14]-、硫酸酯結(jié)合物[M-H+80]-、甲基化硫酸酯結(jié)合物[M-H+94]-、經(jīng)尿液排出體外；膽汁

8、中主要存在著甲基化丹參素。丹參素鈉經(jīng)在體腸灌流、原位肝灌流等實驗后，主要產(chǎn)生甲基化代謝產(chǎn)物，說明這些器官組織中存在著參與其甲基化反應(yīng)的酶。經(jīng)過體外肝勻漿、肝微粒體、腎勻漿、腎微粒體溫孵后，主要代謝產(chǎn)物為甲基化丹參素。丹參素鈉在大鼠肝微粒體酶中代謝的酶動力學(xué)結(jié)果顯示，它在大鼠肝微粒體酶中代謝的Vmax為185.19ng/（mL·min·mg）蛋白，Km為98940.74ng/L，即5.0×10-4mol/L，內(nèi)在代謝清除率Clint為1.