慢性乙型肝炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞和肝組織內(nèi)性甾體激素受體與肝組織病理狀態(tài)的相關(guān)性.pdf

1、研究目的:
　　探討慢性乙型肝炎肝組織內(nèi)和外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)雌激素受體α、雄激素受體mRNA含量與肝組織病理學(xué)狀態(tài)和肝組織HBsAg、 HBcAg表達(dá)強(qiáng)度之間的相關(guān)性。
　　研究方法:
　　1、研究對(duì)象
　　1.1、入選標(biāo)準(zhǔn):參照2010年中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)制訂的《慢性乙型肝炎防治指南》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)，選取經(jīng)過(guò)肝穿刺活檢的慢性乙型肝炎患者162例，性別與年齡不限。
　　1.2、排除標(biāo)準(zhǔn):
　　(1)合

2、并酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、丙型肝炎、藥物性肝炎、自身免疫性肝病、膽汁淤積性肝病、淤血性肝病、肝豆?fàn)詈俗冃?、血色病及其他非乙肝病毒感染?dǎo)致的肝病;
　　(2)近半年內(nèi)曾經(jīng)使用激素替代藥物、或激素拮抗藥物、或抗肝纖維化藥物的患者;
　　(3)肝硬化失代償期患者;
　　(4)性腺疾病、內(nèi)分泌與其他可能影響體內(nèi)睪酮、雌二醇疾病的患者。
　　2、標(biāo)本采集與保存
　　2.1、肝穿組織標(biāo)本采集與保存:肝組織活檢采

3、用1秒鐘經(jīng)皮肝穿刺法。肝組織標(biāo)本采集后分成兩段，長(zhǎng)度分別≥1.0cm和≥0.2cm，分別置入空塑料標(biāo)本管和預(yù)存RNAlater的塑料標(biāo)本管內(nèi)，立即冰凍送檢和放入-80℃凍存。
　　2.2、外周血單個(gè)核細(xì)胞分離與保存:Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，離心后細(xì)胞沉淀加入少量的PBS，使細(xì)胞懸浮，再加入300μL的RNAlater，-80℃冰箱凍存。
　　3、實(shí)驗(yàn)方法
　　3.1、肝組織病理狀態(tài)診斷:肝組織石

4、蠟切片Masson染色和蘇木素-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色，參照2000年西安全國(guó)病毒性肝炎及肝病學(xué)術(shù)會(huì)議修訂的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理學(xué)分級(jí)（grading，G）和分期(staging，S)。
　　3.2、肝組織HBsAg和HBcAg測(cè)定:肝組織石蠟切片HBsAg和HBcAg表達(dá)強(qiáng)度采用免疫組織化學(xué)法（immunohisto-chemistry，IHC）（二步法）測(cè)定。
　　3.3、肝組織膠原纖維面積

5、比測(cè)定:肝組織石蠟切片Masson染色，采用美國(guó)PE公司(PerkinElmer)的智能切片分析系統(tǒng)測(cè)定肝組織膠原纖維的面積比。
　　3.4、肝組織內(nèi)和外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)雌激素受體α、雄激素受體mRNA含量測(cè)定:采用反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)PCR測(cè)定。
　　4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS13.0軟件。肝組織內(nèi)和外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)雌激素受體α、雄激素受體mRNA含量與肝組織病理學(xué)狀態(tài)和肝組織HBsAg、 HBcAg表達(dá)強(qiáng)度之間

6、的相關(guān)性采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，與肝組織膠原纖維面積比之間的相關(guān)性采用Pearson線性相關(guān)分析。肝組織內(nèi)和外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)雌激素受體α、雄激素受體mRNA含量在肝組織不同病理學(xué)分級(jí)、分期之間的差異采用單因素方差分析。性別、年齡、肝組織內(nèi)和外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)雌激素受體α、雄激素受體mRNA含量預(yù)測(cè)肝組織不同病理學(xué)分級(jí)、分期的效能評(píng)價(jià)分別采用Byes逐步判別分析。肝組織內(nèi)和外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)雌激素受體α、雄激素受體mRNA含量

7、預(yù)測(cè)肝組織膠原纖維面積比的評(píng)價(jià)采用曲線估計(jì)。
　　結(jié)果:
　　1、肝組織內(nèi)和外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)雌激素受體α、雄激素受體mRNA含量與患者性別、年齡、肝組織病理分級(jí)和分期、肝組織膠原纖維面積比之間的相關(guān)性
　　肝組織內(nèi)雌激素受體α、雄激素受體mRNA含量與患者性別呈顯著負(fù)相關(guān)（rs=-0.250，P=0.001、rs=-0.206，P=0.008;注:男性賦值為1，女性賦值為0）;與患者年齡呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.298

8、，P=0.000、r=-0.240，P=0.002);與肝組織病理學(xué)分級(jí)、分期之間呈顯著負(fù)相關(guān)（雌激素受體αmRNA: rs=-0.484，P=0.000、rs=0.477，P=0.000;雄激素受體mRNA: rs=-0.591，P=0.000、rs=-0.523，P=0.000）;與肝組織膠原纖維面積比呈顯著負(fù)相關(guān)(r=0.421，P=0.000、r=-0.299，P=0.002);與肝組織HBsAg表達(dá)強(qiáng)度無(wú)顯著相關(guān)性(rs=0.

9、053，P=0.502、rs=0.081，P=0.053)，與肝組織HBcAg表達(dá)強(qiáng)度分別無(wú)顯著相關(guān)性和和呈顯著正相關(guān)(rs=0.101，P=0.202、rs=0.170，P=0.031)。
　　外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)雌激素受體α、雄激素受體mRNA含量與患者性別無(wú)顯著相關(guān)性(rs=0.014，P=0.894、rs=-0.172，P=0.098;注:男性賦值為1，女性賦值為0);與患者年齡無(wú)顯著相關(guān)性(r=-0.099，P=0.357

10、、r=-0.032，P=0.771);與肝組織病理學(xué)分級(jí)、分期之間分別無(wú)顯著相關(guān)性和呈顯著負(fù)相關(guān)（雌激素受體αmRNA:rs=-0.085，P=0.436和rs=-0.012，P=0.913;雄激素受體mRNA: rs=-0.243，P=0.023和rs=-0.326，P=0.002）;與肝組織膠原纖維面積比分別無(wú)顯著相關(guān)性和呈負(fù)相關(guān)(r=-0.051，P=0.702、r=-0.108，P=0.051);與肝組織HBsAg表達(dá)強(qiáng)度無(wú)顯著

11、相關(guān)性(rs=0.143，P=0.184、rs=0.199，P=0.063)，與肝組織HBcAg表達(dá)強(qiáng)度分別無(wú)顯著相關(guān)性(rs=-0.169，P=0.116、rs=-0.085，P=0.430)。
　　2、肝組織內(nèi)和外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)雌激素受體α、雄激素受體mRNA含量在肝組織病理分級(jí)和分期、肝組織之間的差異
　　肝組織內(nèi)雌激素受體α、雄激素受體mRNA含量在不同病理學(xué)分級(jí)之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=30.056，P=0.0

12、00、F=45.819，P=0.000);在不同病理學(xué)分期之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=17.796，P=0.000、F=20.570，P=0.000)。
　　外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)雌激素受體α、雄激素受體mRNA含量在不同病理學(xué)分級(jí)之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.180，P=0.836、F=2.577，P=0.082);雌激素受體αmRNA含量在不同病理學(xué)分級(jí)之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.052，P=0.984)，雄激素受體mRNA

13、含量在不同病理學(xué)分期之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.434，P=0.021)。
　　3、性別、年齡、肝組織內(nèi)和外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)雌激素受體α、雄激素受體含量預(yù)測(cè)肝組織不同病理學(xué)分級(jí)、分期的Byes逐步判別分析
　　以性別、年齡、肝組織內(nèi)和肝組織內(nèi)雌激素受體α、雄激素受體mRNA含量為自變量，肝組織病理學(xué)分級(jí)、分期為因變量，進(jìn)行Byes逐步判別分析。結(jié)果，只有雄激素受體mRNA符合模型自變量納入標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)入判別模型?；谛奂に厥?/p>

14、體的判別肝組織不同病理學(xué)分級(jí)的Fisher判別函數(shù)為:G1=-0.298+2.852×雄激素受體mRNA含量，G2=-1.208-0.098×雄激素受體mRNA含量，G3=-1.892-2.925×雄激素受體mRNA含量?；谛奂に厥荏w的判別肝組織不同病理學(xué)分級(jí)的Fisher判別函數(shù)判別G1、G2、G3的正確率分別為88.9％、12.2％、49.0％。基于雄激素受體的判別肝組織不同病理學(xué)分期的Fisher判別函數(shù)為:S1=-1.413+

15、3.148×雄激素受體mRNA含量，S2=-1.028+0.931×雄激素受體mRNA含量，S3=-2.542-2.215×雄激素受體mRNA含量，S4=-1.685-1.855×雄激素受體mRNA含量?；谛奂に厥荏w的判別肝組織不同病理學(xué)分期的Fisher判別函數(shù)判別S1、S2、S3、S4的正確率分別為48.0％、59.5％、0％和28.9％。
　　以性別、年齡、肝組織內(nèi)和外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)雌激素受體α、雄激素受體mRNA含量為

16、自變量，肝組織病理學(xué)分級(jí)、分期為因變量，進(jìn)行Byes逐步判別分析。結(jié)果，沒(méi)有一項(xiàng)指標(biāo)符合模型自變量納入標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)入判別模型。
　　4、肝組織內(nèi)和外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)雌激素受體α、雄激素受體mRNA含量預(yù)測(cè)肝組織膠原纖維面積比的曲線估計(jì)
　　以肝組織內(nèi)雌激素受體α、雄激素受體mRNA含量為自變量，肝組織膠原纖維面積比為因變量，進(jìn)行曲線擬合。結(jié)果，基于雌受體αmRNA含量預(yù)測(cè)肝組織膠原纖維面積比的回歸模型的決定系數(shù)中，三次方模型的決

17、定系數(shù)最大(R2=0.094);肝組織膠原纖維面積比=0.187-0.128×雌激素受體αmRNA含量+0.081×雌激素受體αmRNA含量2+0.073×雌激素受體αmRNA含量3?；谛奂に厥荏wmRNA含量預(yù)測(cè)肝組織膠原纖維面積比的回歸模型的決定系數(shù)中，三次方模型的決定系數(shù)最大(R2=0.202);肝組織膠原纖維面積比=0.311-2.692×雄激素受體mRNA含量+7.818×雄激素受體mRNA含量2-9.765×雄激素受體mRN

18、A含量3。
　　以外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)雌激素受體α、雄激素受體mRNA含量為自變量，肝組織膠原纖維面積比為因變量，進(jìn)行曲線擬合。結(jié)果，基于雌激素受體α、雄激素受體mRNA含量預(yù)測(cè)肝組織膠原纖維面積比的回歸模型不成立。
　　結(jié)論:
　　1、肝組織內(nèi)雌激素受體α、雄激素受體表達(dá)水平與性別和年齡有關(guān)，男性患者雌激素受體α、雄激素受體表達(dá)水平低于女性患者;青春期及青春期后，隨著年齡增長(zhǎng)，肝組織內(nèi)雌激素受體α、雄激素受體表達(dá)水平逐

19、步降低。肝組織內(nèi)雌激素受體α、雄激素受體表達(dá)可能參與慢性乙型肝炎發(fā)病和進(jìn)展，肝組織內(nèi)雌激素受體α、雄激素受體表達(dá)水平越低，肝組織炎癥活動(dòng)度和纖維化程度越高。肝組織內(nèi)雄激素受體可能促進(jìn)HBcAg表達(dá)。
　　2、外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)雌激素受體α、雄激素受體表達(dá)水平與性別和年齡無(wú)關(guān)。外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)雄激素受體表達(dá)參與慢性乙型肝炎進(jìn)展，外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)雄激素受體表達(dá)水平越低，肝組織纖維化程度越高。外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)雄激素受體表達(dá)不影響肝