慢性乙型肝炎組織病理學(xué)指標及病毒X基因變異與患者預(yù)后的相關(guān)性研究.pdf

1、據(jù)統(tǒng)計，在全世界的慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者中，我國約占一半。對慢性乙型肝炎的基礎(chǔ)研究和臨床診療一直是我國重點。以往對HBV的研究主要集中在血清學(xué)方面，由于HBV在血清和肝斷潛在病變和早期纖維化，最終診斷或除外HBV感染方面有著不可替代的作用。目前，肝穿刺活檢已相當普遍，但對肝穿刺結(jié)果的判定、各項檢測指標之間的相互關(guān)系及和預(yù)后的聯(lián)系，還缺乏系統(tǒng)性評估。 隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，病毒變異在HBV致病與致癌中的作用越來越引起

2、關(guān)注，特別是X基因及其蛋白。X基因是HBV基因組內(nèi)功能重疊最明顯的區(qū)域，其編碼的X蛋白具有廣組織中其病毒狀態(tài)、抗原的含量、血清型和基因型、病變程度等方面均存在顯著差異，難以直觀地反應(yīng)病變的狀態(tài)和嚴重程度，所以肝活體組織檢查越來越成為必要手段，在診泛的反式激活作用，目前被認為是研究HBV致病與致癌作用機制的突破口。以往對X基因及蛋白變異的研究多采用血清標本或在體外細胞水平進行，與體內(nèi)肝細胞中的實際情況有一定差距。肝組織內(nèi)X基因的變異與各組

3、織病理學(xué)指標之間的關(guān)系以及對疾病轉(zhuǎn)歸的影響還未見報道。近年來，在對肝細胞癌發(fā)生機制的研究中，抑癌基因啟動子的高甲基化越來越引起人們的關(guān)注。雖然許多研究證實，肝細胞癌中p161NK4A的高甲基化可被普遍檢出，且HBV感染能顯著增加肝組織p16n~Knn甲基化比率，從而使p16蛋白低表達或不表達，在肝細胞癌形成早期起了重要作用，但其中的機制并不明確。最新體外研究提示，HBV的病毒蛋白和病毒變異可能與此過程有關(guān)，但在人體條件下這種相關(guān)性是否存

4、在，結(jié)果也有待進一步證實。 本研究一方面以較大臨床肝穿刺樣本作為研究對象，通過對慢性乙型肝炎組織病理學(xué)指標(如Scheuer評分、乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、核心抗原(HBcAg)、e抗原(HBeAg)和X蛋白(HBx蛋白)的原位表達，單位肝組織內(nèi)HBVDNA含量)和X基因變異的回顧性研究，明確它們之間的相互關(guān)系及與患者預(yù)后的聯(lián)系，找到可用于肝穿刺活檢的病理輔助診斷指標，對慢性乙型肝炎患者的預(yù)后加以評估及指導(dǎo)臨床診療；另

5、一方面在組織水平研究了HBV病毒蛋白(包括HBsAg、HBcAg和HBx蛋白)以及X基因的變異與p16INK4A甲基化之間的關(guān)系，為HBV介導(dǎo)的肝細胞癌形成機理的研究提供新方向。 第一部分HBV相關(guān)組織病理學(xué)指標和慢性乙型肝炎患者預(yù)后的相關(guān)性研究 目的：通過對慢性乙型肝炎肝穿刺標本中組織病理學(xué)指標和患者預(yù)后的回顧性研究，明確各指標間的相互關(guān)系及和患者預(yù)后的聯(lián)系。 方法：對216例肝穿刺活檢病例進行預(yù)后隨訪，時間為

6、2～18年。根據(jù)隨訪結(jié)果，按有無肝細胞癌的發(fā)生首先將患者分為兩組：癌變組和非癌變組；非癌變組患者又按有無肝硬化的發(fā)生分為硬化組和非硬化組；最后非硬化組患者按血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)水平分為ALT波動組和ALT正常組。肝臟病理損傷程度用Scheuer評分來表示；免疫組化EnVision二步法檢測肝組織HBsAg、HBcAg、HBeAg和HBx蛋白的表達；熒光實時定量PCR檢測單位肝組織內(nèi)HBVDNA的含量。結(jié)果：相關(guān)分析結(jié)果顯示：肝組織內(nèi)

7、HBeAg的表達與慢性肝炎炎癥分級(G分級)呈顯著正相關(guān)(P=0．001)；HBx蛋白的表達與G分級(P=0．008)和纖維化分期(S分期)(P=-0．002)均呈顯著正相關(guān)。部分指標預(yù)后組間也存在差異：硬化組G分級顯著高于非硬化組(P=0．000)，ALT波動組顯著高于ALT正常組(P=0．019)；同樣，硬化組S分期也顯著高于非硬化組(P=0．000)，ALT波動組顯著高于ALT正常組(P=-0．001)；肝組織內(nèi)HBeAg(P=-

8、0．005)和HBx蛋白(P=0．024)的表達在硬化組明顯比非硬化組高。方差分析結(jié)果還顯示HBeAg和HBx蛋白的表達對預(yù)后的影響具有協(xié)同作用：同一病例中兩者肝組織內(nèi)同時表達將大大增加慢性乙型肝炎患者肝硬化的發(fā)生率達38．46％，而單一HBeAg或HBx蛋白表達者為15．07％，兩者均陰性者僅為10．81％。多元參數(shù)的最優(yōu)尺度回歸則顯示Scheuer評分是最重要的判斷預(yù)后的指標。 結(jié)論：肝組織內(nèi)HBeAg和HBx蛋白的表達與慢

9、性乙型肝炎患者肝臟病變的嚴重程度呈正相關(guān)，并顯著增加肝硬化的發(fā)生率；Scheuer評分是判斷患者預(yù)后的最重要指標，其分值越高則患者預(yù)后越差。 第二部分HBVX基因變異與HBV相關(guān)組織病理學(xué)指標和慢性乙型肝炎患者預(yù)后的相關(guān)性研究 目的：研究慢性乙型肝炎患者肝組織內(nèi)HBVX基因部分區(qū)段的變異與各組織病理學(xué)指標的關(guān)系，及其在預(yù)后轉(zhuǎn)歸(特別是肝硬化和肝細胞癌發(fā)生)中的作用。 方法：選取1986～1994年問有完整預(yù)后隨訪

10、資料的83例慢性乙型肝炎肝穿刺活檢病例作為研究對象?；颊甙从袩o肝細胞癌和肝硬化的發(fā)生分為3組：癌變組、硬化組和非硬化組。另取20例HBV相關(guān)性肝細胞癌作為對照研究。從福爾馬林固定、石蠟包埋組織中抽提DNA，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增HBVX基因ntl583～1793區(qū)段，目的條帶經(jīng)膠回收后直接雙向測序。免疫組化EnVision二步法顯示肝組織內(nèi)HBsAg、HBcAg、HBeAg和HBx蛋白的表達；熒光實時定量PCR檢測單位肝組織HBVD

11、NA含量；數(shù)據(jù)處理采用序列分析軟件和統(tǒng)計軟件。 結(jié)果：PCR擴增的目的片段長2¨bp，核苷酸突變發(fā)生于：m1632、1633、1635、1636、1652、1673、1674、1719、1726、1727、1730、1752、1762和1764位點，其中錯義突變主要出現(xiàn)在X蛋白aa87(m1632、1633)、88(mi635、1636)、¨6(ntl719)、¨8(m1726、1727)、¨9(ntl730)、127(m175

12、2)、130(ntl762)和131(ntl764)位氨基酸。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，檢測區(qū)段核苷酸突變率和患者慢性乙型肝炎病史呈顯著正相關(guān)(P--O．005)，肝癌病例的突變率顯著高于慢性肝炎(／'=-0．009)；ntl725～1730(aall8／119)突變與肝組織內(nèi)HBcAg顯著低表達(P=O．006)，和HBVDNA低拷貝數(shù)(P=0．004)明顯相關(guān)，尤以ACTGAC(TD)型突變最為明顯；相反ntl762／1764(aal30／

13、131)位點突變則伴肝組織內(nèi)HBcAg顯著高表達(P=-0．005)和高水平的HBVDNA含量(／'--0．006)。硬化組和非硬化組中各位點野生型和突變型所占比率均未見顯著性差異；但癌變組m1762／1764(aal30／131)突變率顯著高于非癌變患者(P=0．011)；ntl725～1730(aall8／119)野生型(／'--0．024)和ntl762／1764(aal30／131)突變型(P--O．001)在肝癌組所占比率均明

14、顯高于慢性肝炎。 結(jié)論：m1725～1730(aall8／119)和ntl762／1764(aal30／131)突變可能與肝組織內(nèi)HBcAg的表達和HBV的復(fù)制有關(guān)。HBV相關(guān)肝細胞癌中病毒以高復(fù)制型存在。HBV的突變是一個逐漸累積的過程，突變和肝硬化的發(fā)生無關(guān)，而m1762／1764(aal30／131)突變能顯著增加慢性乙型肝炎患者肝細胞癌的發(fā)生機率。 第三部分HBV相關(guān)組織病理學(xué)指標和X基因變異與p16~4A甲基化

15、的相關(guān)性研究 目的：通過研究HBV相關(guān)組織病理學(xué)指標及X基因的變異與p16INK4A甲基化狀態(tài)之間的關(guān)系，明確病毒對p161NK4A甲基化的影響和其在HBV相關(guān)肝細胞癌形成中的作用。 方法：選取23例HBV相關(guān)肝細胞癌和25例慢性乙型肝炎肝穿刺活檢病例作為研究對象，癌與癌旁組織以及肝穿組織中p16INK4A的甲基化狀態(tài)采用甲基化特異性PCR(MSP)進行檢測。免疫組化EnVision二步法顯示肝組織內(nèi)HBsAg、HBcA

16、g、HBeAg和HBx蛋白的表達；熒光實時定量PCR檢測單位肝組織HBVDNA含量。HBVX基因的變異用PCR擴增和直接序列測定來檢測。 結(jié)果：在癌旁組織(／'=0．025)和慢性乙型肝炎(P=0．029)病例中，存在p16INK4A甲基化的病例其肝組織內(nèi)HBx蛋白的表達明顯高于非甲基化病例。但在肝癌組織中，HBx蛋白的表達與p161NK4A甲基化無關(guān)。在所有肝組織中，HBsAg、HBcAg和組織HBVDNA含量均與p16INK