血管抑素的基因導入對大鼠乳腺移植瘤生長抑制作用的研究.pdf

1、目的：腫瘤的生長和轉移都是血管依賴性的，新生血管的生成不僅為腫瘤的生長提供營養(yǎng)，同時也為腫瘤的擴散和轉移提供了可能。研究表明高血管密度是乳腺癌的高危因子之一，新生血管的形成直接和乳腺癌的惡性程度及預后有關，因此，抗腫瘤血管生成已成為近年乳腺癌治療研究的熱點。血管抑素作為腫瘤血管生長的抑制因子，在體外它可以抑制正常血管內皮細胞的增殖和遷移，誘導細胞周期的捕獲和凋亡，且減少內皮細胞的侵襲和血管的形成；而在體內可以抑制多種原發(fā)瘤和轉移瘤的生長

2、。如果它可以抑制乳腺癌的生長，那么血管抑素的抗腫瘤血管生成治療將有望成為乳腺癌治療的新途徑。本研究旨在探討血管抑素(angiostatin)的基因導入對乳腺癌的血管生成及乳腺癌生長抑制的作用。 方法: 1、細胞培養(yǎng)：SD鼠的乳腺腫瘤細胞SHZ88細胞，于含10％小牛血清100IU/ml青霉素和100ug/ml的鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中進行，培養(yǎng)條件為37℃、5％CO<,2>，實驗采用對數(shù)期生長的細胞，調整濃度為5

3、×10<'6>個細胞/100ul生理鹽水，用于建立動物模型。 2、動物模型的建立：出生3-4天的SD鼠共30只，每只SD鼠頸部取一點皮下注射細胞懸液100ul。當腫瘤細胞注射一周后，即鼠體內的腫瘤大約長至0.4cm時，將荷瘤的SD鼠隨機分成兩個實驗組，分別為血管抑素基因導入組和空白對照組，每組15只。 3、血管抑素的基因導入和體內實驗：通過重組的腺相關病毒載體將血管抑素導入體內。血管抑素基因導入組，在腫瘤細胞注射后的第7

4、、14、21、28天各進行一次重組有血管抑素基因的重組腺相關病毒載體(AAV-ANG)的腫瘤內注射，每次注射的劑量為2×10<'9>pfu；空白對照組，腫瘤內每次只注射100ul生理鹽水。 4、測量腫瘤的體積、繪制腫瘤的生長曲線：動物模型建立后，每天監(jiān)測腫瘤的生長情況和SD大鼠的生存情況，每周用游標卡尺測量一次腫瘤的最長、最短徑，計算腫瘤的體積及生長抑制率，繪制皮下腫瘤體積一時間生長曲線。 5、病理組織學檢查：處死SD鼠

5、，觀察移植瘤的形態(tài)。取腫瘤組織固定于福爾馬林溶液中，石蠟包埋，組織切片，常規(guī)HE染色，組織病理檢查。 6、CD34免疫組化染色：運用SABC法，通過抗CD34的兔抗大鼠抗體對腫瘤組織中的血管內皮細胞進行染色。 7、微血管密度的檢測：通過顯微圖象分析系統(tǒng)對微血管密度進行分析。 8、腫瘤內AAV-ANG導入的檢測：運用SP法通過抗AAV-ANG的小鼠抗大鼠的抗體對腫瘤內導入的AAV-ANG進行檢測。 9、統(tǒng)計

6、學處理：用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行分析，數(shù)據(jù)差異顯著性檢驗采用Students’T檢驗，以P<0.05為差異有顯著意義。 結果: 1、血管抑素的基因導入對鼠體內乳腺移植瘤的生長有明顯的抑制作用，并且隨著注射次數(shù)的增加，血管抑素對腫瘤的抑制率也增加。此外，實驗中還觀察到空白對照組帶瘤生存的時間為36天，而血管抑素基因導入組帶瘤生存時間為56天，腺相關病毒載體介導的血管抑素基因導入可能延長鼠帶瘤生存的時間。 2、病理學

7、特征：在SD鼠接種的5天左右頸部可見到腫塊，且腫瘤隨時間的增加而增大。處死SD鼠，取出腫瘤組織，肉眼可見血管抑素基因導入組的腫瘤組織呈蒼白色，與皮膚不粘連，切面可見壞死現(xiàn)象，而空白對照組的腫瘤組織呈鮮紅色，與皮膚有部分粘連，切面可見大量的出血。光鏡下特點：HE染色所示，血管抑素基因導入組可見大量的組織壞死，其周圍瘤細胞核固縮并崩解，因此隨處可見細胞核碎片。空白對照組的核染色質多呈粗塊狀，核分裂相多見，異質性非常明顯，并多處可見粉紅色的微