抗結(jié)核單克隆抗體靶向CT對比劑研制初探.pdf

1、第一部分結(jié)核特異蛋白的原核表達、純化和抗結(jié)核單克隆特異抗體的制備
　　目的：利用已構(gòu)建的基因原核表達重組質(zhì)粒，表達和純化結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)分泌蛋白Ag85B和ESAT-6;利用已分離的雜交瘤細胞，制備和純化抗85B和ESAT-6鼠單克隆抗體。
　　材料與方法：
　　1.擴增培養(yǎng)含重組質(zhì)粒（pET-30a-85B和pET-30a-ESAT6）的表達細菌，收集和裂解

2、細菌，提取重組質(zhì)粒，進行質(zhì)粒DNA聚合酶鏈反應(Polymerase chainreaction，PCR)和酶切鑒定，誘導表達85B和ESA-6蛋白，將誘導的表達產(chǎn)物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析，并純化蛋白作為抗原，定量備用。
　　2.利用雜交瘤技術(shù)分離得到的，針對MTB85B和ESAT-6抗原的雜交瘤細胞（2H4和1B103）株，通過免疫印跡(Western blot)法確認，進行細胞培養(yǎng)，以制備抗85B和ES

3、AT-6鼠單克隆抗體(Monoclonal antibody，MAb)，二氧化硅吸附法純化腹水型單抗。
　　3.采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）鑒定經(jīng)提取重組質(zhì)粒誘導表達的85B和ESAT-6蛋白，與采用雜交瘤技術(shù)獲得的抗85B和ESAT-6鼠單克隆抗體之間的結(jié)合活性。
　　結(jié)果：
　　1.PCR擴增和重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果證實Ag85B和ESAT-

4、6蛋白被成功表達。37℃誘導后為包涵體，通過降低誘導溫度而為可溶性表達。純化后85B和ESAT-6蛋白濃度分別為8.31 mg/mL和2.5mg/mL。SDS-PAGE結(jié)果顯示純度在95％以上，可用來做抗體效價測定。
　　2.分別獲得腹水型單克隆抗體2mg，SDS-PAGE結(jié)果顯示純度在95％以上，滿足后續(xù)對比劑標記所需的量。
　　3.ELISA結(jié)果顯示制備的抗85B和ESAT-6鼠單克隆抗體可與MTB85B和ESAT-6抗

5、原發(fā)生特異反應。抗85B和ESAT-6鼠單克隆抗體純度高，血清效價大于1∶625000。
　　結(jié)論：
　　1.MTB的分泌蛋白Ag85B和ESAT-6被成功表達、純化，并具有良好的免疫原性，為進一步評價單克隆抗體的效價提供靶抗原。
　　2.制得抗85B和ESAT-6鼠單克隆抗體，檢測抗體效價高，為制備本研究中所需的靶向?qū)Ρ葎┨峁嶒灢牧稀?br>　　第二部分抗結(jié)核單克隆抗體靶向CT對比劑的研制
　　目的：對抗85

6、B和ESAT-6鼠單克隆抗體進行碘標記，使其耦聯(lián)，探討靶向CT對比劑的制備可行性及體外生物學活性。
　　材料與方法：
　　1.生物素—親和素系統(tǒng)(Biotin-avidin system，BAS)的放大作用研究
　　以牛血清白蛋白代替抗體，采用Iodogen法分別對牛血清白蛋白進行直接標記以及對BAS化的牛血清白蛋白進行間接放射性碘標記，初步建立其碘標效率的測定方法，并比較直接標記法和利用BAS間接標記法的碘標效率，為

7、優(yōu)化靶向CT對比劑的制備條件提供評價依據(jù)。
　　2.*I-抗鼠單克隆抗體的制備
　　(1)采用氯甘脲(商品名Iodogen)標記法，以放射性碘(Na125I)示蹤非放射性碘(Na127I)分別標記抗85B和ESAT-6鼠單克隆抗體，并以硅膠紙層析法測定其標記率，計算碘結(jié)合量，分離純化測定放化純度，并考察其穩(wěn)定性。
　　(2)以*I-抗85B抗體為例，觀察不同Na127I投料量、不同Iodogen投料量、不同批次Iodo

8、gen反應管對標記的影響，優(yōu)化碘標記的制備條件。
　　(3)利用間接ELISA法測定抗鼠單克隆抗體碘標后與結(jié)核抗原的結(jié)合能力，與同陰性對照OD(Optical density，OD)值相比，大于等于2.1倍者為陽性。
　　3.抗鼠單克隆抗體CT對比劑的制備
　　經(jīng)Iodogen法引入非放射性碘(Na127I)分別標記抗85B和ESAT-6鼠單克隆抗體，采用小樣標記、純化，并計算所制備對比劑溶液中的抗體量和含碘量。

9、>　　結(jié)果：
　　1.生物素—親和素系統(tǒng)(BAS)的放大作用
　　實驗顯示直接標記牛血清白蛋白，其碘與蛋白的摩爾比(mol/mol)達6.372，而采用間接標記法標記的摩爾比僅為0.617。
　　2.*I-抗鼠單克隆抗體的制備
　　(1)碘標抗85B抗體的標記率為(86.25±6.34)％，放化純度＞98％;經(jīng)純化后，蛋白回收率(82.95±4.17)％。在體外4℃條件下存放一周后放化純度＞93％。
　　(

10、2)碘標抗ESAT-6抗體的標記率為(83.07±2.05)％，放化純度＞98％;純化后，蛋白回收率為(36.75±12.80)％。置于4℃條件下，于1天和7天后測定其放化純度，均＞95％。
　　(3)以*I-抗85B抗體為例，當Na127I（0.4μg/μL）投料量分別為5μL、10μL、20μL時，標記率分別為89％、95％、70％;當標記率為95％時每毫克抗85B抗體含有127I64.3μg。計算含Iodogen200μg、

11、100μg、50μg反應管中，標記率分別為70％、95％、93％。測定不同批次(分別制備于2010-2-25;2010-3-23;2010-3-29;2010-3-31)的Iodogen反應管，標記率分別為95％、86％、80％、84％。
　　(4)間接ELISA法檢測，結(jié)果顯示非放射性碘(Na127I)標記抗85B和ESAT-6抗體與結(jié)核抗原仍保持較好的結(jié)合能力。
　　3.抗鼠單克隆抗體CT對比劑的制備
　　(1)純

12、化的127I-抗85B鼠單克隆抗體洗出液共2.52mL;該對比劑溶液中含抗85B抗體質(zhì)量為:210～255μμg;含有127I質(zhì)量為:10.5～16.6μg。
　　(2)純化的127I-抗ESAT-6鼠單克隆抗體收集液共2.93 mL，該對比劑溶液中的抗體量和含碘量分別為:147μg和20.58μg。
　　結(jié)論：
　　1.以*I-抗85B抗體為例，*I-抗鼠單克隆抗體的最佳標記條件為Iodogen100μg，Na125

13、I150μCi，Na127I4μg，抗體50μg，室溫條件下反應5 min，標記率達85％以上，放化純度＞98％，并且穩(wěn)定性好。
　　2.初步制備127I-抗85B和ESAT-6鼠單克隆抗體靶向CT對比劑，具有較好的體外穩(wěn)定性和生物學活性。
　　第三部分結(jié)核靶向CT對比劑在結(jié)核動物模型中的初步觀察
　　一、結(jié)核急性感染動物模型的建立及其綜合評價
　　目的：建立小鼠急性感染MTB的動物模型。
　　材料與方法：

14、
　　1.采用尾靜脈注射和滴鼻方式將結(jié)核分枝桿菌H37Rv標準株菌懸液接種至C57BL/6J小鼠體內(nèi)，隨機分為尾靜脈注射高、中、低劑量組和滴鼻感染組各20只，尾靜脈和滴鼻對照組各5只，比較不同感染途徑和接種菌量對建模的影響。
　　2.在小鼠感染后第4周、6周和8周分別行胸部Micro-CT掃描，觀察動物模型的肺部表現(xiàn)，對圖像質(zhì)量進行評分。
　　3.掃描完成后無菌分離小鼠肺臟，行HE染色、抗酸染色、PAS染色、CD68免

15、疫組化檢測和菌落計數(shù)，觀察MTB在體內(nèi)的定值等。
　　結(jié)果：
　　1.Micro-CT掃描和肉眼觀察發(fā)現(xiàn)，小鼠肺部感染情況隨感染時間延長而逐漸加重，至感染后第6周開始肺部病變明顯，第8周時病變可彌漫全肺。滴鼻組Micro-CT掃描陽性率高，且對病灶顯示的評分高。
　　2.肺組織切片HE染色顯示各感染組肺組織有不同程度的炎性改變。隨著接種菌量的增加，組織病理改變越顯著，滴鼻感染組較尾靜脈各劑量組明顯，抗酸染色可見紅染短小

16、的結(jié)核分枝桿菌。
　　3.兩種方式感染小鼠，肺組織病理學結(jié)果和活菌計數(shù)均表明成功建立了小鼠急性感染結(jié)核病動物模型，感染106cfu/mL菌量可以較好的作為模型感染劑量;菌落計數(shù)顯示各感染組之間無顯著性差異(P＞0.05)。接種菌量一致的情況下，滴鼻組肺組織病理改變較尾靜脈感染組顯著。
　　結(jié)論：
　　1.尾靜脈注射和滴鼻法均可成功建立小鼠急性結(jié)核病感染模型。但滴鼻法建立C57BL/6J小鼠急性感染肺結(jié)核動物模型簡單方便

17、，成模率高。小鼠對實驗操作耐受性好，是較為理想的影像學研究動物模型。
　　2.Micro-CT掃描對結(jié)核動物模型肺部病變敏感，與病理結(jié)果相關(guān)性高，可作為活體動物模型的評價指標之一。
　　二、靶向CT對比劑在結(jié)核急性感染動物模型中的初步觀察
　　目的：探討抗85B和ESAT-6鼠單克隆抗體靶向CT對比劑對小鼠急性感染肺結(jié)核動物模型顯示的可行性。
　　材料與方法：
　　1.采用已純化的抗85B和ESAT-6鼠單

18、克隆抗體與碘原子偶聯(lián)制備靶向CT對比劑，計算對比劑溶液中抗體含量和結(jié)合127I含量，稀釋后配制成5μgI/ml備用。
　　2.將20只小鼠急性感染肺結(jié)核動物模型，分為靶向?qū)Ρ葎┙M（10只）、普通對比劑組（5只）和空白對照組;其中靶向?qū)Ρ葎┙M根據(jù)注射對比劑成分的不同，又分為85B組和ESAT-6組（每組各5只）;普通對比劑組注射相同含碘濃度的碘海醇稀釋液;空白對照組注射PBS（抗體稀釋液）。分別于注射對比劑前、注射對比劑后(即刻、6

19、h、12h、24h)不同時間行Micro-CT掃描，觀察小鼠肺內(nèi)病變的顯示情況。
　　結(jié)果：
　　1.實驗所制備的2.52 mL抗85B對比劑溶液中含有210～255μg抗體，10.5～16.6μg127I;2.93 mL抗ESAT-6對比劑溶液中含有抗體147μg，結(jié)合的127I約20.58μg。
　　2.對照組小鼠肺內(nèi)病變在注射PBS前后，均未見強化。靶向?qū)Ρ葎┙M小鼠肺內(nèi)病變的CT值隨時間延長而逐漸升高，在注射對比