小鵝瘟單克隆抗體的研制及應(yīng)用研究.pdf

1、小鵝瘟是一種傳播快、死亡率高的傳染病。由于其病情急、病程短，因此，早發(fā)現(xiàn)、早治療對(duì)控制本病十分重要。近年來(lái)，小鵝瘟病多繼發(fā)其他疾病或與其他傳染性疾病并發(fā)，其臨床癥狀和病理解剖都缺乏特征性，這樣就給疾病的診斷和防治造成巨大困難，必須通過(guò)試驗(yàn)室診斷方可確診。 目前，實(shí)驗(yàn)室診斷方法有病毒的分離鑒定、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等數(shù)種，它們或存在耗時(shí)長(zhǎng)、敏感性低，或存在設(shè)備昂貴等缺點(diǎn)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)方法具有方便、敏感和快

2、速的特點(diǎn)，可以直接檢測(cè)出病料中的小鵝瘟病毒，但是由于其超敏感的特點(diǎn)，也易造成假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果，只有用純化的抗原或者抗體，才可以避免假陽(yáng)性和假陰性的結(jié)果出現(xiàn)。與上述幾種實(shí)驗(yàn)室診斷方法相比，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)對(duì)儀器設(shè)備要求不高，臨床上容易做到，如果利用純化的抗原或者抗體便可以避免假陽(yáng)性和假陰性的結(jié)果出現(xiàn)，單克隆抗體便可彌補(bǔ)這個(gè)缺陷。與常規(guī)抗體相比，單克隆抗體純度更高，特異性更好，并且一經(jīng)研制出，便可大量地生產(chǎn)。如使用酶標(biāo)單克隆

3、抗體來(lái)進(jìn)行ELISA試驗(yàn)以鑒定小鵝瘟病毒，就可以將ELISA方法和單抗的優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來(lái)，為快速、準(zhǔn)確診斷小鵝瘟探索了一種新方法。這便是本文的目的所在。 由于ELISA試驗(yàn)結(jié)果受試驗(yàn)工作條件影響很大，而文獻(xiàn)報(bào)道的試驗(yàn)條件不盡一致。故本文對(duì)間接ELISA的各步工作條件進(jìn)行了比較和篩選，建立了穩(wěn)定、可靠的ELISA檢測(cè)方法。通過(guò)淋巴細(xì)胞融合技術(shù)，以50％PEG (分子量3350)作為融合劑，將以GPV程序化免疫的BALB/C小鼠脾細(xì)胞和

4、腫瘤細(xì)胞系SP2/0細(xì)胞融合。通過(guò)間接ELISA試驗(yàn)篩選出陽(yáng)性細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)并亞克隆。最后研制出6株抗小鵝瘟病毒(GPV)雜交瘤細(xì)胞，分別命名為2A6A9、4C7C5、1H3H5、4E3D9、2A9H1和3G1D5。以雜交瘤細(xì)胞陽(yáng)性株注射BALB/C小鼠制取腹水后測(cè)定其效價(jià)達(dá)10<'-5>。以間接ELISA法測(cè)定單克隆抗體特異性，鑒定單克隆抗體亞類，結(jié)果表明所得到的均為IgG1型單抗，并且特異針對(duì)小鵝瘟病毒。測(cè)定凍存前和凍存后20天雜交

5、瘤細(xì)胞上清液間接ELISA效價(jià)，通過(guò)效價(jià)的變化，評(píng)價(jià)所獲得的雜交瘤細(xì)胞對(duì)于凍存的穩(wěn)定性，結(jié)果表明雜交瘤細(xì)胞對(duì)于凍存有較好的穩(wěn)定性。 文中利用獲得的抗小鵝瘟單克隆抗體與HRP交聯(lián)，建立了快速、特異檢測(cè)小鵝瘟病毒的間接夾心ELISA法。用得到的辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的單抗做ELISA以檢測(cè)GPV、NDV、AI-H9和DHV，結(jié)果表明抗小鵝瘟病毒的單抗與NDV、AIV-H9、DHV病毒不反應(yīng)，僅與本實(shí)驗(yàn)的GPV毒株反應(yīng)。說(shuō)明用該方法診斷小鵝