胃癌干細胞的分離鑒定及其在胃癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用與分子機制.pdf

1、胃癌是嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤,在東亞、東歐和南美等地區(qū)高發(fā),其死亡率居惡性腫瘤第二位,盡管近年來手術(shù)、化療及生物治療等多種治療方法的進步,胃癌患者的5年生存率仍然較低,究其原因是我們對胃癌的發(fā)生發(fā)展機制尚不十分清楚。
　　近年來腫瘤干細胞(cancerstemcells,CSCs)理論的興起為我們深入認(rèn)識胃癌的發(fā)生發(fā)展機制提供了新的思路。本研究中我們使用成球培養(yǎng)法從胃癌細胞中分離/富集了胃癌干細胞(gastriccancers

2、temcells,GCSCs),并發(fā)現(xiàn)GCSCs具有高侵襲轉(zhuǎn)移和多藥耐藥的特性。通過芯片分析,我們篩選出在GCSCs中一系列差異表達的基因及miRNA分子,發(fā)現(xiàn)炭疽毒素2型受體(anthraxtoxinreceptor2,ANTXR2)在GCSCs中表達增高尤為突出,因此進一步研究了ANTXR2在調(diào)控GCSCs自我更新維持及侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及其可能的分子機制,并探討了其在胃癌標(biāo)本中表達的臨床意義。
　　主要方法、研究結(jié)果及結(jié)論如下

3、:
　　1、使用成球培養(yǎng)法成功分離/富集GCSCs,并進行了生物學(xué)特性鑒定。
　　(1)建立了胃癌細胞成球培養(yǎng)的方法,胃癌細胞SGC7901、MGC803和BGC823在無血清干細胞培養(yǎng)基和低黏附培養(yǎng)板培養(yǎng)條件下能夠成球生長,并能夠連續(xù)傳代;(2)實時定量PCR及Westernblot方法檢測發(fā)現(xiàn)細胞球細胞(spherecells,SC)較單層培養(yǎng)細胞(monolayercells,MN)高表達干性相關(guān)基因Sox2、Oct4

4、和Bmi1;(3)克隆形成實驗表明SGC7901-SC的克隆形成能力強于SGC7901-MN細胞(156±5vs35±2,P<0.05);(4)SGC7901-SC細胞于含血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時,可發(fā)現(xiàn)其分化標(biāo)記物CK18,氫鉀ATP酶(H-K-ATPase)陽性的細胞增加;(5)移植瘤實驗表明同數(shù)量級的SGC7901-SC比SGC7901-MN細胞具有更強的腫瘤形成能力,且SGC7901-SC形成的移植瘤中CK18和H-K-ATPase

5、陽性細胞的比例比SGC7901-MN低(分別為13％±4%vs94%±2%,20%±4%vs42%±3%,P<0.05),說明SGC7901-SC細胞更加幼稚。上述結(jié)果從干性基因表達、克隆形成能力、多向分化能力和成瘤能力等幾個主要方面證實了成球生長的細胞具有CSCs的特性。
　　2、GCSCs呈EMT表型并具有高侵襲轉(zhuǎn)移潛能。
　　(1)在SGC7901-SC及SGC7901-MN形成的體內(nèi)移植瘤中我們發(fā)現(xiàn),SGC7901-

6、SC形成的移植瘤浸潤周圍組織并有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,而SGC7901-MN細胞形成的移植瘤具有完整的包膜。(2)實時定量PCR及Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)SGC7901-SC較SGC7901-MN高表達Vimentin和MMP2,低表達E-cadherin,呈現(xiàn)EMT表型。(3)體外Transwell小室侵襲實驗發(fā)現(xiàn)SGC7901-SC較SGC7901-MN具有更強的侵襲能力(153±16vs51±12,P<0.05);
　　3、GC

7、SCs具有多藥耐藥特性。
　　(1)化療藥殺傷實驗發(fā)現(xiàn)SGC7901-SC較SGC7901-MN具有更強的化療藥5-Fu、DDP和ADR耐受能力。(2)實時定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)SGC7901-SC較SGC7901-MN高表達ABCC4,低表達MDR1,而MRP1和ABCG2的表達無明顯差異。
　　4、發(fā)現(xiàn)GCSCs與單層培養(yǎng)細胞差異表達的一系列基因及miRNA分子。通過信號通路分析發(fā)現(xiàn)Wnt、Notch信號通路、TGFβ信號通

8、路、VEGF信號通路、p450細胞色素家族及抗凋亡信號通路在GCSCs活化,提示其可能在GCSCs的自我更新、侵襲轉(zhuǎn)移、多藥耐藥和誘導(dǎo)脈管生成中發(fā)揮重要作用。
　　5、通過基因芯片篩選出GCSCs高表達分子ANTXR2,發(fā)現(xiàn)ANTXR2在調(diào)控胃癌細胞的成球及成瘤能力及侵襲轉(zhuǎn)移中具有重要作用。
　　(1)實時定量PCR及流式分析發(fā)現(xiàn)ANTXR2在GCSCs上高表達;(2)免疫熒光雙染發(fā)現(xiàn)ANTXR2與GCSCs標(biāo)志物CD44具

9、有共定位現(xiàn)象;(3)利用慢病毒干擾SGC7901和XN0422細胞ANTXR2的表達后,可以顯著抑制胃癌細胞的成球能力、增殖能力、成瘤能力和侵襲轉(zhuǎn)移能力;(4)發(fā)現(xiàn)過表達ANTXR2后可以增強胃癌細胞AGS和HGC27的克隆形成能力。
　　6、探討了ANTXR2調(diào)控胃癌細胞干性維持及侵襲轉(zhuǎn)移的可能分子機制。
　　(1)利用慢病毒干擾SGC7901和XN0422細胞ANTXR2的表達后,可以顯著抑制胃癌細胞干性相關(guān)分子β-ca

10、tenin、Sox2、Bmi1和CD44的表達,同時其EMT標(biāo)志物Vimentin表達降低,E-cadherin上升;(2)對穩(wěn)定干擾ANTXR2的SGC7901細胞進行基因芯片及信號通路分析,發(fā)現(xiàn)MAPK信號通路改變最大。使用MAPK信號通路關(guān)鍵靶點抑制劑SB203580、PD98059及SP600125作用于過表達ANTXR2的HGC27細胞發(fā)現(xiàn),ERK磷酸化抑制劑PD98059及JNK磷酸化SP600125都能顯著抑制該細胞的克隆

11、形成能力,而以PD98059的作用更為顯著;(3)Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)在穩(wěn)定干擾ANTXR2的SGC7901細胞中ERK的磷酸化水平降低,同時Src-Tyr416磷酸化降低,Src-Tyr527磷酸化增加,提示ANTXT2的作用可能通過Src/ERK信號通路。7、發(fā)現(xiàn)ANTXR2在胃癌標(biāo)本中表達具有重要的臨床意義。對181例胃癌標(biāo)本免疫組化染色檢測結(jié)果顯示,ANTXR2的表達與胃癌患者TNM分期(P=0.024),浸潤深度(P

12、=0.03)成正相關(guān),而與患者的生存時間成負(fù)相關(guān)(P=0.006)。ANTXR2可以用作判斷胃癌預(yù)后的指標(biāo)。
　　本文的主要結(jié)論如下:成球培養(yǎng)法是一種能夠成功分離/富集GCSCs的有效方法;所獲得的GCSCs具有自我更新、高成瘤、高侵襲轉(zhuǎn)移和多藥耐藥的特性;其特性可能依賴于Wnt、Notch信號通路、TGFβ信號通路、p450細胞色素家族和抗凋亡信號通路的活化;ANTXR2在GCSCs干性維持及侵襲轉(zhuǎn)移調(diào)控中發(fā)揮重要作用,其調(diào)控作