胃癌干細(xì)胞的分離鑒定及其在胃癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用與分子機(jī)制.pdf

1、胃癌是嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤,在東亞、東歐和南美等地區(qū)高發(fā),其死亡率居惡性腫瘤第二位,盡管近年來(lái)手術(shù)、化療及生物治療等多種治療方法的進(jìn)步,胃癌患者的5年生存率仍然較低,究其原因是我們對(duì)胃癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制尚不十分清楚。
　　近年來(lái)腫瘤干細(xì)胞(cancerstemcells,CSCs)理論的興起為我們深入認(rèn)識(shí)胃癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供了新的思路。本研究中我們使用成球培養(yǎng)法從胃癌細(xì)胞中分離/富集了胃癌干細(xì)胞(gastriccancers

2、temcells,GCSCs),并發(fā)現(xiàn)GCSCs具有高侵襲轉(zhuǎn)移和多藥耐藥的特性。通過(guò)芯片分析,我們篩選出在GCSCs中一系列差異表達(dá)的基因及miRNA分子,發(fā)現(xiàn)炭疽毒素2型受體(anthraxtoxinreceptor2,ANTXR2)在GCSCs中表達(dá)增高尤為突出,因此進(jìn)一步研究了ANTXR2在調(diào)控GCSCs自我更新維持及侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及其可能的分子機(jī)制,并探討了其在胃癌標(biāo)本中表達(dá)的臨床意義。
　　主要方法、研究結(jié)果及結(jié)論如下

3、:
　　1、使用成球培養(yǎng)法成功分離/富集GCSCs,并進(jìn)行了生物學(xué)特性鑒定。
　　(1)建立了胃癌細(xì)胞成球培養(yǎng)的方法,胃癌細(xì)胞SGC7901、MGC803和BGC823在無(wú)血清干細(xì)胞培養(yǎng)基和低黏附培養(yǎng)板培養(yǎng)條件下能夠成球生長(zhǎng),并能夠連續(xù)傳代;(2)實(shí)時(shí)定量PCR及Westernblot方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞球細(xì)胞(spherecells,SC)較單層培養(yǎng)細(xì)胞(monolayercells,MN)高表達(dá)干性相關(guān)基因Sox2、Oct4

4、和Bmi1;(3)克隆形成實(shí)驗(yàn)表明SGC7901-SC的克隆形成能力強(qiáng)于SGC7901-MN細(xì)胞(156±5vs35±2,P<0.05);(4)SGC7901-SC細(xì)胞于含血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí),可發(fā)現(xiàn)其分化標(biāo)記物CK18,氫鉀ATP酶(H-K-ATPase)陽(yáng)性的細(xì)胞增加;(5)移植瘤實(shí)驗(yàn)表明同數(shù)量級(jí)的SGC7901-SC比SGC7901-MN細(xì)胞具有更強(qiáng)的腫瘤形成能力,且SGC7901-SC形成的移植瘤中CK18和H-K-ATPase

5、陽(yáng)性細(xì)胞的比例比SGC7901-MN低(分別為13％±4%vs94%±2%,20%±4%vs42%±3%,P<0.05),說(shuō)明SGC7901-SC細(xì)胞更加幼稚。上述結(jié)果從干性基因表達(dá)、克隆形成能力、多向分化能力和成瘤能力等幾個(gè)主要方面證實(shí)了成球生長(zhǎng)的細(xì)胞具有CSCs的特性。
　　2、GCSCs呈EMT表型并具有高侵襲轉(zhuǎn)移潛能。
　　(1)在SGC7901-SC及SGC7901-MN形成的體內(nèi)移植瘤中我們發(fā)現(xiàn),SGC7901-

6、SC形成的移植瘤浸潤(rùn)周圍組織并有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,而SGC7901-MN細(xì)胞形成的移植瘤具有完整的包膜。(2)實(shí)時(shí)定量PCR及Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SGC7901-SC較SGC7901-MN高表達(dá)Vimentin和MMP2,低表達(dá)E-cadherin,呈現(xiàn)EMT表型。(3)體外Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SGC7901-SC較SGC7901-MN具有更強(qiáng)的侵襲能力(153±16vs51±12,P<0.05);
　　3、GC

7、SCs具有多藥耐藥特性。
　　(1)化療藥殺傷實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SGC7901-SC較SGC7901-MN具有更強(qiáng)的化療藥5-Fu、DDP和ADR耐受能力。(2)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SGC7901-SC較SGC7901-MN高表達(dá)ABCC4,低表達(dá)MDR1,而MRP1和ABCG2的表達(dá)無(wú)明顯差異。
　　4、發(fā)現(xiàn)GCSCs與單層培養(yǎng)細(xì)胞差異表達(dá)的一系列基因及miRNA分子。通過(guò)信號(hào)通路分析發(fā)現(xiàn)Wnt、Notch信號(hào)通路、TGFβ信號(hào)通

8、路、VEGF信號(hào)通路、p450細(xì)胞色素家族及抗凋亡信號(hào)通路在GCSCs活化,提示其可能在GCSCs的自我更新、侵襲轉(zhuǎn)移、多藥耐藥和誘導(dǎo)脈管生成中發(fā)揮重要作用。
　　5、通過(guò)基因芯片篩選出GCSCs高表達(dá)分子ANTXR2,發(fā)現(xiàn)ANTXR2在調(diào)控胃癌細(xì)胞的成球及成瘤能力及侵襲轉(zhuǎn)移中具有重要作用。
　　(1)實(shí)時(shí)定量PCR及流式分析發(fā)現(xiàn)ANTXR2在GCSCs上高表達(dá);(2)免疫熒光雙染發(fā)現(xiàn)ANTXR2與GCSCs標(biāo)志物CD44具

9、有共定位現(xiàn)象;(3)利用慢病毒干擾SGC7901和XN0422細(xì)胞ANTXR2的表達(dá)后,可以顯著抑制胃癌細(xì)胞的成球能力、增殖能力、成瘤能力和侵襲轉(zhuǎn)移能力;(4)發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)ANTXR2后可以增強(qiáng)胃癌細(xì)胞AGS和HGC27的克隆形成能力。
　　6、探討了ANTXR2調(diào)控胃癌細(xì)胞干性維持及侵襲轉(zhuǎn)移的可能分子機(jī)制。
　　(1)利用慢病毒干擾SGC7901和XN0422細(xì)胞ANTXR2的表達(dá)后,可以顯著抑制胃癌細(xì)胞干性相關(guān)分子β-ca

10、tenin、Sox2、Bmi1和CD44的表達(dá),同時(shí)其EMT標(biāo)志物Vimentin表達(dá)降低,E-cadherin上升;(2)對(duì)穩(wěn)定干擾ANTXR2的SGC7901細(xì)胞進(jìn)行基因芯片及信號(hào)通路分析,發(fā)現(xiàn)MAPK信號(hào)通路改變最大。使用MAPK信號(hào)通路關(guān)鍵靶點(diǎn)抑制劑SB203580、PD98059及SP600125作用于過(guò)表達(dá)ANTXR2的HGC27細(xì)胞發(fā)現(xiàn),ERK磷酸化抑制劑PD98059及JNK磷酸化SP600125都能顯著抑制該細(xì)胞的克隆

11、形成能力,而以PD98059的作用更為顯著;(3)Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在穩(wěn)定干擾ANTXR2的SGC7901細(xì)胞中ERK的磷酸化水平降低,同時(shí)Src-Tyr416磷酸化降低,Src-Tyr527磷酸化增加,提示ANTXT2的作用可能通過(guò)Src/ERK信號(hào)通路。7、發(fā)現(xiàn)ANTXR2在胃癌標(biāo)本中表達(dá)具有重要的臨床意義。對(duì)181例胃癌標(biāo)本免疫組化染色檢測(cè)結(jié)果顯示,ANTXR2的表達(dá)與胃癌患者TNM分期(P=0.024),浸潤(rùn)深度(P

12、=0.03)成正相關(guān),而與患者的生存時(shí)間成負(fù)相關(guān)(P=0.006)。ANTXR2可以用作判斷胃癌預(yù)后的指標(biāo)。
　　本文的主要結(jié)論如下:成球培養(yǎng)法是一種能夠成功分離/富集GCSCs的有效方法;所獲得的GCSCs具有自我更新、高成瘤、高侵襲轉(zhuǎn)移和多藥耐藥的特性;其特性可能依賴于Wnt、Notch信號(hào)通路、TGFβ信號(hào)通路、p450細(xì)胞色素家族和抗凋亡信號(hào)通路的活化;ANTXR2在GCSCs干性維持及侵襲轉(zhuǎn)移調(diào)控中發(fā)揮重要作用,其調(diào)控作