整合素ανβ6與MMp-9在胃癌預(yù)后及侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制中的作用研究.pdf

1、本文主要從以下幾方面進(jìn)行論述：
　　第一部分 整合素αvβ6和MMP-9在胃癌預(yù)后中的作用研究
　　目的：
　　檢測(cè)整合素αvβ6和基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9在胃癌組織中的表達(dá)，分析兩者陽(yáng)性表達(dá)與預(yù)后因子的相關(guān)性，評(píng)估它們?cè)谖赴╊A(yù)后監(jiān)測(cè)中的作用。
　　方法：
　　1.采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)整合素αvβ6和基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9在126例原發(fā)性胃癌組織中的表達(dá)。
　　2.所有組織樣本的免疫組化染色結(jié)果

2、和各種臨床病理指標(biāo)之間的相關(guān)性分析，通過(guò)卡方檢驗(yàn)完成評(píng)估。
　　3.整合素αvβ6和基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9陽(yáng)性表達(dá)的相關(guān)性分析，通過(guò)雙變量相關(guān)分析完成評(píng)估。
　　4.患者術(shù)后隨訪3個(gè)月一次，兩年之后至少6個(gè)月一次，中位隨訪時(shí)間為56個(gè)月。
　　5.按照整合素αvβ6和基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9的不同表達(dá)組合，將患者分為四組:αvβ6(+)/MMP-9(+)組、αvβ6(-)/MMP-9(-)組、αvβ6(+)/MMP-

3、9（-）組和αvβ6（-）/MMP-9(+)組，以便分析不同組合在胃癌預(yù)后中的相對(duì)作用。
　　6.生存曲線之間的差異性由對(duì)數(shù)秩(Log-rank)檢驗(yàn)完成評(píng)估，并采用Kaplan-Meier生存分析和Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型最終評(píng)估獨(dú)立的預(yù)后因子。
　　結(jié)果：
　　1.整合素αvβ6和MMP-9在126例胃癌患者中明顯高表達(dá)，其陽(yáng)性表達(dá)率分別為34.92％和42.06％。
　　2.與整合素αvβ6的陽(yáng)性表達(dá)相關(guān)的臨

4、床因素為L(zhǎng)auren分型、分化、淋巴結(jié)分期和TNM分期（P值分別為0.006，0.038，0.016和0.002），而與MMP-9的陽(yáng)性表達(dá)相關(guān)的臨床因素為分化、腫瘤分期、淋巴結(jié)分期和TNM分期(P值分別為0.039，0.014，0.033和0.008)。
　　3.通過(guò)雙變量相關(guān)分析證實(shí)，整合素αvβ6的陽(yáng)性表達(dá)和MMP-9的陽(yáng)性表達(dá)呈密切正相關(guān)。
　　4.Kaplan-Meier生存分析表明，整合素αvβ6陽(yáng)性表達(dá)或MMP

5、-9陽(yáng)性表達(dá)患者的生存時(shí)間比整合素αvβ6陰性表達(dá)或MMP-9陰性表達(dá)患者的生存時(shí)間短，而且整合素αvβ6和MMP-9都陽(yáng)性表達(dá)的患者的生存時(shí)間最短（P值=0.000）。
　　5.Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型顯示，整合素αvβ6和MMP-9陽(yáng)性表達(dá)、彌散型Lauren分型以及較高的N期、M期和TNM分期是影響胃癌不良預(yù)后的因素;只有整合素αvβ6和MMP-9是胃癌不良預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)（相關(guān)系數(shù)分別為2.632和1.813，P值分別為0.0

6、03和0.007）。
　　結(jié)論：
　　整合素αvβ6和基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9在胃癌中的高表達(dá)密切相關(guān)，兩個(gè)指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)在胃癌患者術(shù)后的預(yù)后監(jiān)測(cè)中可作為更有效的預(yù)測(cè)指標(biāo)。
　　第二部分 整合素αvβ6對(duì)MMP-9表達(dá)的影響及其在胃癌細(xì)胞侵襲中的作用
　　目的：
　　研究整合素αvβ6對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9在mRNA和蛋白水平上表達(dá)的影響，以及整合素αvβ6和MMP-9在胃癌細(xì)胞侵襲、遷移中的作用。

7、>　　方法：
　　1.選用β6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染以上調(diào)人胃癌前GES-1細(xì)胞中整合素αvβ6的表達(dá)，將GES-1細(xì)胞分成三組:對(duì)照組、空白質(zhì)粒組和質(zhì)粒上調(diào)組。通過(guò)western blot檢測(cè)整合素αvβ6的表達(dá)，以檢驗(yàn)β6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的效果，為進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。
　　2.選用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染siRNA以干擾人胃癌AGS細(xì)胞中整合素αvβ6的表達(dá)，將AGS細(xì)胞分成三組:對(duì)照組、siRNA陰性干擾組和siRNA干擾組。通過(guò)western blot

8、檢測(cè)整合素αvβ6的表達(dá)，以檢驗(yàn)siRNA的干擾效果，為進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。
　　3.采用逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)，分別檢測(cè)GES-1細(xì)胞和胃癌AGS細(xì)胞各組中MMP-9在mRNA水平的表達(dá)。
　　4.采用ELISA的方法，分別檢測(cè)GES-1細(xì)胞和胃癌AGS細(xì)胞各組中MMP-9在蛋白水平的表達(dá)。
　　5.采用Transwell侵襲小室和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)胃癌AGS各組細(xì)胞的侵襲和遷移能力的變化。
　　結(jié)果：
　　1

9、.人胃癌前GES-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染β6質(zhì)粒后，經(jīng)western blot證實(shí)，整合素αvβ6的表達(dá)在質(zhì)粒上調(diào)組明顯上調(diào)，空白質(zhì)粒組中整合素αvβ6的表達(dá)相較于對(duì)照組沒(méi)有明顯差異，說(shuō)明GES-1細(xì)胞中整合素αvβ6的上調(diào)效果明顯，可用于后續(xù)研究。
　　2.人胃癌AGS細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA后，經(jīng)western blot證實(shí)，整合素αvβ6的表達(dá)在siRNA干擾組明顯下調(diào)，siRNA陰性干擾組中整合素αvβ6的表達(dá)相較于對(duì)照組沒(méi)有明顯差異，說(shuō)明

10、AGS細(xì)胞中整合素αvβ6的干擾效果明顯，可用于后續(xù)研究。
　　3.逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，人胃癌前GES-1細(xì)胞經(jīng)β6質(zhì)粒過(guò)表達(dá)上調(diào)整合素αvβ6的表達(dá)后，基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9在mRNA水平相較于對(duì)照組也隨之上調(diào)，而空白質(zhì)粒組的MMP-9在mRNA水平相較于對(duì)照組沒(méi)有明顯差異;人胃癌AGS細(xì)胞經(jīng)siRNA干擾下調(diào)整合素αvβ6的表達(dá)后，基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9在mRNA水平相較于對(duì)照組也隨之下調(diào)，而siRNA陰性干擾組的MM

11、P-9在mRNA水平相較于對(duì)照組沒(méi)有明顯差異。
　　4.ELISA檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，人胃癌前GES-1細(xì)胞經(jīng)β6質(zhì)粒過(guò)表達(dá)上調(diào)整合素αvβ6的表達(dá)后，基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9的蛋白水平相較于對(duì)照組也隨之上調(diào)， 而空白質(zhì)粒組的MMP-9的蛋白水平相較于對(duì)照組沒(méi)有明顯差異;人胃癌AGS細(xì)胞經(jīng)siRNA干擾下調(diào)整合素αvβ6的表達(dá)后，基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9的蛋白水平相較于對(duì)照組也隨之下調(diào)，而siRNA陰性干擾組的MMP-9的蛋白水平相較于對(duì)

12、照組沒(méi)有明顯差異。
　　5.Transwell侵襲小室和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，人胃癌AGS細(xì)胞經(jīng)siRNA干擾下調(diào)整合素αvβ6的表達(dá)后，細(xì)胞的侵襲和遷移能力相較于對(duì)照組也隨之變?nèi)?，而siRNA陰性干擾組的侵襲和遷移能力相較于對(duì)照組沒(méi)有明顯差異。
　　結(jié)論:
　　本部分實(shí)驗(yàn)表明，人胃癌前GES-1細(xì)胞經(jīng)β6質(zhì)粒過(guò)表達(dá)上調(diào)整合素αvβ6的表達(dá)后，MMP-9在mRNA和蛋白水平均明顯上調(diào);人胃癌AGS細(xì)胞經(jīng)siRNA干擾

13、下調(diào)整合素αvβ6的表達(dá)后，MMP-9在mRNA和蛋白水平均明顯下調(diào)，且細(xì)胞的侵襲和遷移能力也隨之變?nèi)酢Ｕ纤卅羦β6通過(guò)調(diào)控MMP-9促進(jìn)了胃癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。該部分研究從細(xì)胞的微觀角度解釋了整合素αvβ6和基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9在胃癌組織中的高表達(dá)密切相關(guān)以及在胃癌患者術(shù)后的預(yù)后監(jiān)測(cè)中的作用。
　　第三部分 ERK/MAPK信號(hào)通路介導(dǎo)整合素αvβ6調(diào)控MMP-9機(jī)制的研究
　　目的:
　　研究ERK/MA

14、PK信號(hào)通路對(duì)整合素αvβ6調(diào)控MMP-9影響。
　　方法:
　　1.在β6質(zhì)粒過(guò)表達(dá)的GES-1細(xì)胞和整合素αvβ6高表達(dá)的胃癌AGS細(xì)胞中分別加入ERK抑制劑PD98059，通過(guò)western blot檢測(cè)ERK的表達(dá)，以檢驗(yàn)ERK的干擾效果，為進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。
　　2.采用逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)，分別檢測(cè)β6質(zhì)粒過(guò)表達(dá)的GES-1細(xì)胞和整合素αvβ6高表達(dá)的胃癌AGS細(xì)胞干擾ERK的表達(dá)前后MMP-9在mRNA水平

15、的表達(dá)。
　　3.采用ELISA的方法，分別檢測(cè)β6質(zhì)粒過(guò)表達(dá)的GES-1細(xì)胞和整合素αvβ6高表達(dá)的胃癌AGS細(xì)胞干擾ERK的表達(dá)前后MMP-9在蛋白水平的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.ERK抑制劑PD98059加入β6質(zhì)粒過(guò)表達(dá)的GES-1細(xì)胞和整合素αvβ6高表達(dá)的胃癌AGS細(xì)胞后，經(jīng)western blot證實(shí)，ERK的表達(dá)較未加入PD98059組均明顯下調(diào)，說(shuō)明這兩種細(xì)胞中ERK的抑制效果明顯，可用于后續(xù)研究。

16、
　　2.逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，ERK抑制劑PD98059加入β6質(zhì)粒過(guò)表達(dá)的GES-1細(xì)胞和整合素αvβ6高表達(dá)的胃癌AGS細(xì)胞后，基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9在mRNA水平較未加入PD98059組均明顯下調(diào)。
　　3.ELISA檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，ERK抑制劑PD98059加入β6質(zhì)粒過(guò)表達(dá)的GES-1細(xì)胞和整合素αvβ6高表達(dá)的胃癌AGS細(xì)胞后，基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9的蛋白水平較未加入PD98059組均明顯下調(diào)。
　　結(jié)

17、論:本部分實(shí)驗(yàn)表明，在β6質(zhì)粒過(guò)表達(dá)的GES-1細(xì)胞和整合素αvβ6高表達(dá)的胃癌AGS細(xì)胞中分別加入ERK抑制劑PD98059后，隨著ERK表達(dá)的明顯下調(diào)，基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9在mRNA和蛋白水平相較于抑制ERK表達(dá)前均明顯下調(diào)。這說(shuō)明ERK介導(dǎo)了整合素αvβ6對(duì)MMP-9的調(diào)控，ERK/MAPK信號(hào)通路對(duì)整合素αvβ6調(diào)控MMP-9進(jìn)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為有重要影響。本部分研究明確了整合素αvβ6胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制