LncRNA-AK058003在缺氧誘導胃癌侵襲轉移中的作用及機制研究.pdf

1、胃癌細胞發(fā)生遠處轉移是導致胃癌患者死亡的主要原因。近年研究都僅局限于腫瘤細胞內部的變化,而忽略了侵襲轉移的發(fā)生在體內是腫瘤微環(huán)境與細胞相互作用的結果。眾所周知,缺氧是實體瘤中普遍存在的現(xiàn)象,能夠促進腫瘤多種惡性表型的發(fā)生。近年來學者們越來越關注腫瘤微環(huán)境的特殊性對轉移發(fā)生的作用。缺氧可以通過誘導HIF-1a等因子,轉錄激活眾多基因參與腫瘤細胞的侵襲轉移,導致患者治療失敗。因此,深入研究缺氧誘導的信號通路,尋找可以有效逆轉腫瘤發(fā)生發(fā)展的分

2、子靶點,能為阻斷胃癌轉移提供理論依據。
　　長鏈非編碼RNA(lncRNA)是近年來備受矚目的一類長度大于200nt的非編碼RNA,能夠在多個層面調控基因表達,是當前腫瘤研究的熱點。已有文獻證實部分lncRNAs在腫瘤轉移中發(fā)揮重要作用。因此,深入探討lncRNAs在缺氧腫瘤中的作用及其分子機制,將有助于全面深入地理解缺氧誘導胃癌侵襲轉移發(fā)生的過程和調節(jié)機制。
　　目的:
　　1.高通量篩選出缺氧相關的差異表達lncR

3、NAs;
　　2.對其中的關鍵lncRNA的表達進行驗證探討其在胃癌組織中的表達水平與癌旁中的相關性;
　　3.進一步探討關鍵分子在缺氧誘導胃癌侵襲轉移中的作用及機制。
　　方法:
　　1.SGC7901,MKN45,MKN28三個胃癌細胞系,分別經常氧/缺氧孵育24h后,Trizol法提取3例配對的胃癌細胞總RNA,利用高通量lncRNA芯片比較它們之間的表達譜差異。
　　2.通過差異倍數(shù)、鄰近編碼基因信

4、息分析、長度特征分析等策略初步篩選與缺氧誘導胃癌侵襲轉移相關的關鍵分子。
　　3.RT-PCR的方法檢測lncRNA-AK058003在缺氧誘導的胃癌細胞中相對于常氧條件下的表達水平;進一步檢測其在20例胃癌臨床標本中相對于癌旁組織的表達水平;
　　4.構建小干擾RNA慢病毒,穩(wěn)定下調AK058003在SGC7901及MKN45中的表達。Transwell、劃痕實驗、裸鼠尾靜脈注入不同胃癌細胞等體外和體內實驗檢測抑制AK05

5、8003后對常氧和缺氧條件下胃癌侵襲轉移的影響。
　　5.生物信息學預測AK058003的靶基因,利用RT-PCR和western blot實驗檢測下調AK058003對靶基因的影響。
　　6.利用免疫組化實驗檢測靶基因在胃癌及癌旁組織中的表達情況。
　　7.構建SNCG正義表達載體和小干擾RNA載體,將其轉染入SGC7901和MKN45,westernblot檢測其表達量變化,Transwell實驗檢測常氧條件下SN

6、CG對胃癌侵襲轉移的影響。
　　8.在AK058003下調的穩(wěn)定細胞株SGC7901-siAK和MKN45-siAK中轉染SNCG正義表達載體,westernblot驗證后,Transwell檢測常氧條件下SNCG在AK058003介導的胃癌侵襲轉移的作用。
　　9.利用westernblot檢測缺氧條件下,下調AK058003后對SNCG蛋白表達的影響。Transwell實驗探索SNCG是否參與了缺氧誘導的胃癌細胞的侵襲轉

7、移。
　　10.缺氧條件下在AK058003穩(wěn)定下調的細胞株SGC7901-siAK和MKN45-siAK中轉染SNCG正義表達載體,Transwell檢測缺氧條件下胃癌細胞侵襲轉移的變化,從而探討SNCG在AK058003介導的缺氧誘導胃癌侵襲轉移的作用。
　　結果:
　　1.高通量lncRNA芯片比較發(fā)現(xiàn):缺氧誘導的胃癌細胞SGC7901、MKN45和MKN28與常氧條件下的細胞相比,有84條在缺氧誘導的胃癌細胞中

8、顯著上調(P<0.05),其中差異倍數(shù)在3倍以上的共有5個。
　　2.多步篩選策略提示AK058003可能是缺氧誘導胃癌侵襲轉移的關鍵lncRNA分子之一。
　　3.RT-PCR結果顯示:AK058003在缺氧誘導的胃癌細胞中顯著上調,其分別在SGC7901缺氧16h,MKN45缺氧24h,MKN28缺氧48h時達到峰值。進一步RT-PCR結果發(fā)現(xiàn),AK058003在胃癌組織中的表達水平顯著高于癌旁組織。
　　4.常氧

9、條件下,干擾AK058003的表達后,SGC7901和MKN45的遷移侵襲能力明顯下降。缺氧條件下的Transwell實驗結果顯示缺氧能夠顯著增加SGC7901和MKN45的侵襲轉移力,而抑制AK058003的表達后,缺氧條件下胃癌細胞侵襲轉移力明顯下降。
　　5.生物信息學分析發(fā)現(xiàn)在AK058003下游8.3kb處有轉移相關基因SNCG(乳腺癌轉移相關基因)。RT-PCR和westernblot實驗結果顯示下調AK058003后

10、,SNCGmRNA和蛋白表達水平也明顯下調。
　　6.免疫組化結果顯示SNCG在胃癌組織中的表達顯著高于癌旁組織,在發(fā)生轉移的胃癌原發(fā)灶中的表達明顯強于未發(fā)生轉移的胃癌原發(fā)灶。進一步對SNCG與胃癌病人的臨床參數(shù)進行分析后發(fā)現(xiàn),SNCG與胃癌病人的TNM分期、侵潤深度和淋巴結轉移密切相關,但與病人的年齡,性別和分化程度并無關聯(lián)。
　　7.與對照組細胞比較,下調SNCG后,SGC7901和MKN45的侵襲能力明顯下降,而上調S

11、NCG后,SGC7901和MKN45的侵襲能力明顯增強。
　　8.常氧條件下,在AK058003下調的穩(wěn)定細胞株中過表達SNCG后,與對照組細胞(SGC7901-siAK和MKN45-siAK)相比,上調SNCG表達后,胃癌細胞的侵襲轉移能力得到了逆轉。
　　9.Westernblot結果顯示,SNCG在缺氧胃癌細胞中的表達明顯上調,而抑制AK058003的表達后,缺氧條件下SNCG的上調趨勢消失。缺氧條件下的Transwe

12、ll實驗結果顯示干擾SNCG的表達后,缺氧條件下胃癌細胞侵襲轉移力明顯下降。這說明SNCG參與了缺氧誘導的胃癌細胞的侵襲轉移。
　　10.缺氧條件下,在AK058003下調的穩(wěn)定細胞株中過表達SNCG后,與對照組細胞(SGC7901-siAK和MKN45-siAK)相比較,上調SNCG表達后,缺氧胃癌細胞的侵襲轉移能力得到了逆轉。這說明SNCG參與了AK058003介導的缺氧胃癌細胞的侵襲轉移。
　　結論:
　　1.通