LncRNA-AK058003在缺氧誘導(dǎo)胃癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、胃癌細(xì)胞發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致胃癌患者死亡的主要原因。近年研究都僅局限于腫瘤細(xì)胞內(nèi)部的變化,而忽略了侵襲轉(zhuǎn)移的發(fā)生在體內(nèi)是腫瘤微環(huán)境與細(xì)胞相互作用的結(jié)果。眾所周知,缺氧是實(shí)體瘤中普遍存在的現(xiàn)象,能夠促進(jìn)腫瘤多種惡性表型的發(fā)生。近年來學(xué)者們越來越關(guān)注腫瘤微環(huán)境的特殊性對轉(zhuǎn)移發(fā)生的作用。缺氧可以通過誘導(dǎo)HIF-1a等因子,轉(zhuǎn)錄激活眾多基因參與腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致患者治療失敗。因此,深入研究缺氧誘導(dǎo)的信號通路,尋找可以有效逆轉(zhuǎn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的分

2、子靶點(diǎn),能為阻斷胃癌轉(zhuǎn)移提供理論依據(jù)。
　　長鏈非編碼RNA(lncRNA)是近年來備受矚目的一類長度大于200nt的非編碼RNA,能夠在多個層面調(diào)控基因表達(dá),是當(dāng)前腫瘤研究的熱點(diǎn)。已有文獻(xiàn)證實(shí)部分lncRNAs在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。因此,深入探討lncRNAs在缺氧腫瘤中的作用及其分子機(jī)制,將有助于全面深入地理解缺氧誘導(dǎo)胃癌侵襲轉(zhuǎn)移發(fā)生的過程和調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　目的:
　　1.高通量篩選出缺氧相關(guān)的差異表達(dá)lncR

3、NAs;
　　2.對其中的關(guān)鍵lncRNA的表達(dá)進(jìn)行驗證探討其在胃癌組織中的表達(dá)水平與癌旁中的相關(guān)性;
　　3.進(jìn)一步探討關(guān)鍵分子在缺氧誘導(dǎo)胃癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及機(jī)制。
　　方法:
　　1.SGC7901,MKN45,MKN28三個胃癌細(xì)胞系,分別經(jīng)常氧/缺氧孵育24h后,Trizol法提取3例配對的胃癌細(xì)胞總RNA,利用高通量lncRNA芯片比較它們之間的表達(dá)譜差異。
　　2.通過差異倍數(shù)、鄰近編碼基因信

4、息分析、長度特征分析等策略初步篩選與缺氧誘導(dǎo)胃癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的關(guān)鍵分子。
　　3.RT-PCR的方法檢測lncRNA-AK058003在缺氧誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞中相對于常氧條件下的表達(dá)水平;進(jìn)一步檢測其在20例胃癌臨床標(biāo)本中相對于癌旁組織的表達(dá)水平;
　　4.構(gòu)建小干擾RNA慢病毒,穩(wěn)定下調(diào)AK058003在SGC7901及MKN45中的表達(dá)。Transwell、劃痕實(shí)驗、裸鼠尾靜脈注入不同胃癌細(xì)胞等體外和體內(nèi)實(shí)驗檢測抑制AK05

5、8003后對常氧和缺氧條件下胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的影響。
　　5.生物信息學(xué)預(yù)測AK058003的靶基因,利用RT-PCR和western blot實(shí)驗檢測下調(diào)AK058003對靶基因的影響。
　　6.利用免疫組化實(shí)驗檢測靶基因在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)情況。
　　7.構(gòu)建SNCG正義表達(dá)載體和小干擾RNA載體,將其轉(zhuǎn)染入SGC7901和MKN45,westernblot檢測其表達(dá)量變化,Transwell實(shí)驗檢測常氧條件下SN

6、CG對胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的影響。
　　8.在AK058003下調(diào)的穩(wěn)定細(xì)胞株SGC7901-siAK和MKN45-siAK中轉(zhuǎn)染SNCG正義表達(dá)載體,westernblot驗證后,Transwell檢測常氧條件下SNCG在AK058003介導(dǎo)的胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用。
　　9.利用westernblot檢測缺氧條件下,下調(diào)AK058003后對SNCG蛋白表達(dá)的影響。Transwell實(shí)驗探索SNCG是否參與了缺氧誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)

7、移。
　　10.缺氧條件下在AK058003穩(wěn)定下調(diào)的細(xì)胞株SGC7901-siAK和MKN45-siAK中轉(zhuǎn)染SNCG正義表達(dá)載體,Transwell檢測缺氧條件下胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的變化,從而探討SNCG在AK058003介導(dǎo)的缺氧誘導(dǎo)胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用。
　　結(jié)果:
　　1.高通量lncRNA芯片比較發(fā)現(xiàn):缺氧誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞SGC7901、MKN45和MKN28與常氧條件下的細(xì)胞相比,有84條在缺氧誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞中

8、顯著上調(diào)(P<0.05),其中差異倍數(shù)在3倍以上的共有5個。
　　2.多步篩選策略提示AK058003可能是缺氧誘導(dǎo)胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵lncRNA分子之一。
　　3.RT-PCR結(jié)果顯示:AK058003在缺氧誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞中顯著上調(diào),其分別在SGC7901缺氧16h,MKN45缺氧24h,MKN28缺氧48h時達(dá)到峰值。進(jìn)一步RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn),AK058003在胃癌組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織。
　　4.常氧

9、條件下,干擾AK058003的表達(dá)后,SGC7901和MKN45的遷移侵襲能力明顯下降。缺氧條件下的Transwell實(shí)驗結(jié)果顯示缺氧能夠顯著增加SGC7901和MKN45的侵襲轉(zhuǎn)移力,而抑制AK058003的表達(dá)后,缺氧條件下胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移力明顯下降。
　　5.生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)在AK058003下游8.3kb處有轉(zhuǎn)移相關(guān)基因SNCG(乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因)。RT-PCR和westernblot實(shí)驗結(jié)果顯示下調(diào)AK058003后

10、,SNCGmRNA和蛋白表達(dá)水平也明顯下調(diào)。
　　6.免疫組化結(jié)果顯示SNCG在胃癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織,在發(fā)生轉(zhuǎn)移的胃癌原發(fā)灶中的表達(dá)明顯強(qiáng)于未發(fā)生轉(zhuǎn)移的胃癌原發(fā)灶。進(jìn)一步對SNCG與胃癌病人的臨床參數(shù)進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn),SNCG與胃癌病人的TNM分期、侵潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān),但與病人的年齡,性別和分化程度并無關(guān)聯(lián)。
　　7.與對照組細(xì)胞比較,下調(diào)SNCG后,SGC7901和MKN45的侵襲能力明顯下降,而上調(diào)S

11、NCG后,SGC7901和MKN45的侵襲能力明顯增強(qiáng)。
　　8.常氧條件下,在AK058003下調(diào)的穩(wěn)定細(xì)胞株中過表達(dá)SNCG后,與對照組細(xì)胞(SGC7901-siAK和MKN45-siAK)相比,上調(diào)SNCG表達(dá)后,胃癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力得到了逆轉(zhuǎn)。
　　9.Westernblot結(jié)果顯示,SNCG在缺氧胃癌細(xì)胞中的表達(dá)明顯上調(diào),而抑制AK058003的表達(dá)后,缺氧條件下SNCG的上調(diào)趨勢消失。缺氧條件下的Transwe

12、ll實(shí)驗結(jié)果顯示干擾SNCG的表達(dá)后,缺氧條件下胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移力明顯下降。這說明SNCG參與了缺氧誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。
　　10.缺氧條件下,在AK058003下調(diào)的穩(wěn)定細(xì)胞株中過表達(dá)SNCG后,與對照組細(xì)胞(SGC7901-siAK和MKN45-siAK)相比較,上調(diào)SNCG表達(dá)后,缺氧胃癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力得到了逆轉(zhuǎn)。這說明SNCG參與了AK058003介導(dǎo)的缺氧胃癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。
　　結(jié)論:
　　1.通