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文檔簡介
1、研究背景和目的:
肥胖和2型糖尿病狀態(tài)下的長期低水平炎癥反應(yīng)是心血管疾病發(fā)生的重要病理基礎(chǔ)。近年來,關(guān)于人外周血免疫細(xì)胞亞群的研究發(fā)現(xiàn)了許多與炎癥密切相關(guān)的細(xì)胞亞群,其中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(RegulatoryTcells,Treg),高表達(dá)CD16的單核細(xì)胞,高表達(dá)CD146的T細(xì)胞等尤其受到關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)胰島素具有顯著的抗炎、抗氧化應(yīng)激等作用,胰島素是否可以通過對上述細(xì)胞進(jìn)行調(diào)節(jié)而發(fā)揮其抗炎作用尚不明確。有前期研究發(fā)現(xiàn)胰島素療法
2、可以增加外周血CD34+干/祖細(xì)胞數(shù)量,而胰島素是否對CD34+細(xì)胞有直接動員作用尚待明確。
另外,單核細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞粘附是動脈粥樣硬化發(fā)病的重要環(huán)節(jié),而胰島素對其調(diào)控作用目前尚無統(tǒng)一認(rèn)識。
因此,本研究擬探討上述炎癥細(xì)胞亞群在人群中的分布規(guī)律并探討胰島素靜脈輸注是否可以對上述細(xì)胞亞群水平進(jìn)行調(diào)節(jié),同時探討胰島素對人單核-內(nèi)皮細(xì)胞粘附的影響。
方法:
第一部分:外周血炎癥細(xì)胞亞群的流式細(xì)胞分析及優(yōu)
3、化
探討保存時間、紅細(xì)胞裂解、固定/透膜液選擇對流式細(xì)胞染色的影響及對TLR2和TLR4在不同細(xì)胞的表達(dá)進(jìn)行初步觀察,優(yōu)化確定本課題的流式細(xì)胞染色方案,并對各細(xì)胞亞群在健康人群中的表達(dá)進(jìn)行初步分析。
第二部分:炎癥細(xì)胞亞群在代謝綜合征及2型糖尿病人群中的分布及增齡變化
招募代謝綜合征、2型糖尿病及健康受試者,通過流式細(xì)胞技術(shù)觀察外周血Treg細(xì)胞、CD16+單核細(xì)胞、CD146+T細(xì)胞、CD34+干/祖細(xì)胞
4、等水平,及單核細(xì)胞中TLR2、TLR4的表達(dá)。進(jìn)行組間比較,并對一般資料、血清指標(biāo)和流式細(xì)胞結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析。
第三部分:胰島素輸注對人外周血炎癥細(xì)胞亞群的影響
給予非糖尿病肥胖受試者輸注胰島素(與葡萄糖同時輸注以防止低血糖)14小時,分離0、4、8小時時間點(diǎn)的新鮮單個核細(xì)胞,行流式細(xì)胞染色觀察,同時觀察NF-κB核轉(zhuǎn)位和血漿炎癥分子水平。受試者間隔2周再次接受單純葡萄糖或生理鹽水輸注作為對照。
第四部分
5、:胰島素對單核-內(nèi)皮細(xì)胞粘附的影響及機(jī)制探討
通過CFDA-SE標(biāo)記法觀察胰島素和/或LPS對HAEC和THP-1細(xì)胞粘附的影響。通過共培養(yǎng)與流式細(xì)胞分選,real-timePCR,觀察共培養(yǎng)的HAEC細(xì)胞ICAM-1、TNF-α和THP-1細(xì)胞TNF-α、SOCS-3的表達(dá)水平變化。
結(jié)果:
第一部分
細(xì)胞即時染色并固定,4℃保存過夜可保證時間差對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響最小,F(xiàn)icoll分選單個核細(xì)胞后
6、染色比全血染色及紅細(xì)胞裂解的染色效果更為穩(wěn)定。我們檢測到的健康人外周血各炎癥細(xì)胞亞群的水平與文獻(xiàn)報道相符。
第二部分
CD146+T細(xì)胞在2型糖尿病組的水平顯著高于其余兩組。CD34+干/祖細(xì)胞在2型糖尿病組呈下降趨勢,TLR2及TLR4在2型糖尿病組有上升趨勢,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Treg細(xì)胞和CD16+單核細(xì)胞在三組間無顯著差異。
CD34+細(xì)胞水平與年齡負(fù)相關(guān),CD146+T細(xì)胞水平與年齡正相關(guān)。Treg
7、水平與血糖負(fù)相關(guān)。CD16+/CD14+單核細(xì)胞水平與甘油三酯負(fù)相關(guān)。
第三部分
胰島素輸注可以上調(diào)Treg水平,下調(diào)炎癥性單核細(xì)胞水平,抑制外周血單個核細(xì)胞NF-κB的胞核轉(zhuǎn)位和血漿MMP-9、MCP-1表達(dá)。但胰島素輸注對于CD146+T細(xì)胞水平并未產(chǎn)生顯著影響。胰島素輸注在8小時內(nèi)未對CD34+干/祖細(xì)胞水平產(chǎn)生影響。TLR2及TLR4未產(chǎn)生顯著改變。
第四部分
LPS干預(yù)4小時可以促進(jìn)TH
8、P-1細(xì)胞與HAEC的粘附,而胰島素可以劑量依賴性地顯著抑制LPS對THP-1/HAEC粘附的刺激作用。
胰島素體外干預(yù)4小時下調(diào)HAEC的ICAM-1及TNF-α表達(dá),下調(diào)THP-1細(xì)胞的TNF-α及SOCS-3表達(dá)并抑制LPS的上調(diào)作用。
結(jié)論:
1.對于不同時間點(diǎn)人外周血標(biāo)本的流式細(xì)胞比較研究,采用即時分離單個核細(xì)胞染色并固定的方法,可以更好地減少混雜因素干擾。
2.人外周血各炎癥細(xì)胞亞群在
9、代謝綜合征和2型糖尿病狀態(tài)下及隨著年齡增加發(fā)生一系列變化,表現(xiàn)為CD146+T細(xì)胞在2型糖尿病狀態(tài)下上調(diào)及隨年齡增加而上調(diào),Treg水平隨血糖升高而下降,CD34+干/祖細(xì)胞水平隨年齡增加而下調(diào),提示代謝綜合征、2型糖尿病及高齡時的高炎癥狀態(tài)及體內(nèi)抗炎、修復(fù)能力的增齡性下降。
3.胰島素輸注可以上調(diào)人外周血的Treg水平并下調(diào)炎癥性單核細(xì)胞水平,提示胰島素的抗炎作用新機(jī)制。同時胰島素輸注對人外周血單個核細(xì)胞NF-κB核轉(zhuǎn)位和M
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