精氨酸加壓素對(duì)抗Aβ-,25-35-神經(jīng)毒性作用的行為學(xué)和電生理研究.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是發(fā)生在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種慢性、原發(fā)性、不可逆性的神經(jīng)退行性疾病，以學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能障礙、精神行為異常為主要臨床表現(xiàn)。AD典型的病理學(xué)特征包括腦內(nèi)出現(xiàn)高密度的老年斑(細(xì)胞外)和神經(jīng)元纖維纏結(jié)(細(xì)胞內(nèi))。其中，老年斑中主要的神經(jīng)毒性成分是由39-43個(gè)氨基酸組成的β淀粉樣蛋白(Amyloidβ-protein,Aβ)。目前，有關(guān)Aβ及其有效片段如Aβ25-35、Aβ31-35的

2、神經(jīng)毒作用已有廣泛報(bào)道，故一般認(rèn)為，AD的發(fā)病與Aβ在腦內(nèi)的沉積以及由此產(chǎn)生的神經(jīng)毒性作用有關(guān)。然而，Aβ發(fā)揮神經(jīng)毒性作用的細(xì)胞和分子機(jī)制很復(fù)雜，迄今為止還不十分清楚，也還缺乏有效的針對(duì)Aβ的抗AD藥物。
　　 精氨酸加壓素(Arginine vasopressin,AVP)作為神經(jīng)遞質(zhì)主要由視交叉上核、床紋終核、杏仁核和室旁核的神經(jīng)分泌小細(xì)胞所產(chǎn)生，是9個(gè)氨基酸構(gòu)成的多肽。AVP的生理作用較廣泛，在外周血中以激素形式主要調(diào)節(jié)體

3、內(nèi)水電解質(zhì)平衡及調(diào)節(jié)血壓，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)以神經(jīng)遞質(zhì)或神經(jīng)調(diào)質(zhì)可以影響和調(diào)節(jié)腦的高級(jí)功能如學(xué)習(xí)和記憶。有研究表明，AD患者腦內(nèi)和血漿內(nèi)AVP水平與正常人相比有明顯減少，這提示AD的發(fā)病可能與AVP在腦和血漿中的水平下降有關(guān)。此外AVP對(duì)老年人記憶的改善已有臨床報(bào)道，提示AVP可能具有對(duì)抗A神經(jīng)毒性的作用，在防治AD、改善記憶障礙方面可能發(fā)揮重要作用。然而，迄今為止關(guān)于AVP在神經(jīng)保護(hù)作用的行為學(xué)和電生理研究方面仍然存在分歧：此外，雖然有實(shí)

4、驗(yàn)表明Aβ能夠損害大鼠學(xué)習(xí)和記憶功能，AVP可能與之相反，但AVP是否能夠逆轉(zhuǎn)或部分拮抗Aβ對(duì)認(rèn)知功能的傷害至今仍未見報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)的目的主要是利用行為學(xué)實(shí)驗(yàn)手段進(jìn)一步確定腦室內(nèi)注射AVP是否能影響大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力，特別是AVP的預(yù)處理是否能夠保護(hù)學(xué)習(xí)記憶功能免受Aβ的傷害。同時(shí)，我們還采用分子生物學(xué)和電生理手段檢測(cè)了海馬組織磷酸化Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(p-CaMKⅡ)的表達(dá)水平以及海馬神經(jīng)元的放電頻率，以探討

5、AVP發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)的細(xì)胞和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
　　 本研究進(jìn)行了如下三部分工作：(1)利用國(guó)際公認(rèn)的經(jīng)典的Morris水迷宮測(cè)試手段，檢測(cè)了側(cè)腦室注射AVP對(duì)Aβ25-35損害大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力的拮抗效應(yīng)；(2)利用Western blot技術(shù)檢測(cè)了Aβ25-35和AVP對(duì)大鼠海馬組織p-CaMKⅡ表達(dá)水平的影響；(3)利用多通道細(xì)胞外記錄和鋒電位分類技術(shù)，觀察了側(cè)腦室注射Aβ25-35和AVP對(duì)大鼠在體海馬CA1區(qū)神經(jīng)元自

6、發(fā)放電活動(dòng)類型及頻率的影響，以及AVP對(duì)Aβ影響海馬神經(jīng)元自發(fā)放電活動(dòng)的調(diào)制作用。由此，本研究從細(xì)胞、分子到行為學(xué)三個(gè)水平探討了AVP對(duì)抗Aβ神經(jīng)毒性作用的生物學(xué)效應(yīng)及其機(jī)制，旨在為AD的發(fā)病機(jī)制以及AD的防治提供可能的新思路。
　　 第一部分、精氨酸加壓素阻止Aβ25-35引起的大鼠空間學(xué)習(xí)記憶傷害
　　 目的：本實(shí)驗(yàn)通過使用Morris水迷宮方法探討AVP對(duì)抗Aβ所致大鼠空間學(xué)習(xí)、記憶功能傷害的神經(jīng)保護(hù)作用。

7、　　 方法：實(shí)驗(yàn)取運(yùn)動(dòng)靈活、無(wú)視力障礙的成年雄性Wistar大鼠(230-250g)隨機(jī)分為對(duì)照組、Aβ25-35組、不同濃度AVP組、以及AVP和Aβ25-35聯(lián)合給予組，每組10只。行Morris水迷宮定位航行和空間探索實(shí)驗(yàn)，分別測(cè)定大鼠空間定位學(xué)習(xí)和記憶能力。主要指標(biāo)包括大鼠尋找平臺(tái)的平均逃避潛伏期和游過距離、撤除平臺(tái)后大鼠在目標(biāo)象限游泳時(shí)間和游過距離占游泳總時(shí)間或總距離的百分比。同時(shí)，測(cè)定各組大鼠的游泳速度和視力，以除外運(yùn)動(dòng)和

8、視力障礙對(duì)測(cè)定指標(biāo)的影響。
　　 結(jié)果：(1)對(duì)照組大鼠逃避潛伏期在訓(xùn)練的第1、2、3、4、5天分別為73.7±6.5 s，55.4±10.1 s，28.9±7.5 s，11.2±2.3 s和9.5±1.2 s；大鼠找到平臺(tái)所游過距離分別為1799.9±242.6cm，1723.7±143.8 cm，677.5±176.4 cm，273.6±53.7 cm和223±29.3 cm；撤除平臺(tái)后動(dòng)物在目標(biāo)象限所花時(shí)間占游泳總時(shí)間的百

9、分比為49.3±0.3％；目標(biāo)象限內(nèi)游過距離占總距離的百分比為49.6±0.2％。(2)腦室注射Aβ25-35(25 nmol)顯著降低了大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力，與對(duì)照組相比，平均逃避潛伏期和游泳距離兩個(gè)指標(biāo)在各時(shí)間點(diǎn)均明顯延長(zhǎng)(P＜0.01)；撤除平臺(tái)后動(dòng)物在目標(biāo)象限所花時(shí)間占游泳總時(shí)間的百分比減少至35.1±0.3％，游過距離占總距離的百分比也減少至35.1±0.2％，與對(duì)照組相比顯著縮短(P＜0.01)。(3)給予低劑量(0.1

10、 nmol/5ul)的AVP后，學(xué)習(xí)、記憶功能輕度提高，但與對(duì)照組比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)；給予中等劑量(1 nmol/5ul)和高劑量(10 nmol/5ul)AVP后，大鼠定位航行與空間探索能力均明顯增強(qiáng)(P＜0.01)平均逃避潛伏期和找到平臺(tái)所游過的距離均明顯縮短(P＜0.01)。撤除平臺(tái)后，1 nmol組動(dòng)物在目標(biāo)象限所花時(shí)間占游泳總時(shí)間的百分比較對(duì)照組增加到57.9±0.03％，游過距離占總距離的百分比增加到58.1

11、±0.04％(P＜0.01)；10 nmol組動(dòng)物分別增加為67.6±0.02％和67.1±0.04％(P＜0.01)。(4)聯(lián)合給予AVP和Aβ25-35后，不同劑量的AVP對(duì)Aβ25-35所致的定向航行和空間探索能力均顯示出一定的劑量依賴性保護(hù)效應(yīng)。在0.1 nmol組，AVP對(duì)Aβ25-35的行為學(xué)傷害未顯示出明顯的改善(P＞0.05)；用1 nmol和10 nmol AVP處理后，平均逃避潛伏期和尋找平臺(tái)距離明顯小于單獨(dú)使用Aβ

12、25-35組(P＜0.05)，空間探索實(shí)驗(yàn)則顯示：聯(lián)合給藥的1 nmol和10 nmol AVP組.在目標(biāo)象限所花時(shí)間和游過距離占游泳總時(shí)間或距離的百分比較單獨(dú)使用Aβ25-35組明顯增加(P＜0.01)，1 nmol組分別為46.8±0.01％和47.1±0.02％；10 nmol組分別為52.2±0.02％和52.3±0.04％。(5)可視平臺(tái)測(cè)試結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，各處理組大鼠游泳速度和視力沒有明顯區(qū)別(P＞0.05)，表明大

13、鼠的運(yùn)動(dòng)功能和視力沒有受到所給藥物的影響。
　　 結(jié)論：腦室內(nèi)注射Aβ25-35能夠明顯傷害大鼠空間定位的學(xué)習(xí)和記憶功能；腦室內(nèi)單獨(dú)給予AVP(1 nmol和10 nmol)能夠在一定程度上提高大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力，而AVP預(yù)處理能夠有效對(duì)抗Aβ25-35引起的大鼠空間學(xué)習(xí)記憶損傷，顯示出一定的劑量依賴性神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)。提示中樞AVP系統(tǒng)活動(dòng)的上調(diào)可能對(duì)阿爾茨海默病的預(yù)防和治療具有積極的作用。
　　 第二部分、精氨酸加壓素和

14、Aβ25-35對(duì)大鼠海馬CaMKⅡ磷酸化水平的影響
　　 目的：本實(shí)驗(yàn)使用Western blot技術(shù)檢測(cè)了慢性側(cè)腦室注射Aβ25-35和AVP對(duì)大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞質(zhì)膜上磷酸化Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(phosphorylated Ca2+/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ，p-CaMKⅡ)表達(dá)的影響，以揭示AVP在行為學(xué)上對(duì)抗Aβ的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)機(jī)制。
　　 方法：行為學(xué)結(jié)

15、束后，四組大鼠(對(duì)照組、Aβ25-35組、AVP組、以及AVP和Aβ25-35聯(lián)合給予組)斷頭處死，取腦并分離出海馬，組織進(jìn)行超聲勻漿、提取蛋白，然后采用Westernblot檢測(cè)海馬神經(jīng)元質(zhì)膜上p-CaMKⅡ的表達(dá)。
　　 結(jié)果：(1)對(duì)照組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞質(zhì)膜上p-CaMKⅡ表達(dá)量的平均灰度值為0.601±0.01(n=7)。(2)與對(duì)照組相比，給予10 nmolAVP后大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞質(zhì)膜上p-CaMKⅡ的表達(dá)量增加，平均

16、灰度值為0.747±0.02，(n=7;P＜0.01)。(3)與對(duì)照組相比，給予Aβ25-35(25nmol/5ul)后大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞質(zhì)膜上p-CaMKⅡ的表達(dá)量下降，平均灰度值為0.48±0.03(n=7;P＜0.01)。
　　 結(jié)論：腦室注射AVP能夠提高海馬神經(jīng)細(xì)胞質(zhì)膜上p-CaMKⅡ的表達(dá)；腦室注射Aβ25-35能夠抑制海馬神經(jīng)細(xì)胞質(zhì)膜上p-CaMKⅡ的表達(dá)；AVP預(yù)處理能夠在一定程度上對(duì)抗Aβ25-35對(duì)海馬神經(jīng)細(xì)胞

17、質(zhì)膜上p-CaMKⅡ表達(dá)量的抑制作用。這提示Aβ和AVP對(duì)大鼠學(xué)習(xí)、記憶行為學(xué)的影響可能與海馬磷酸化CaMKⅡ的表達(dá)量有密切關(guān)系。
　　 第三部分、精氨酸加壓素保護(hù)大鼠在體海馬神經(jīng)元自發(fā)放電免受Aβ25-35的傷害
　　 目的：本實(shí)驗(yàn)通過使用多電極細(xì)胞外記錄技術(shù)，觀察慢性側(cè)腦室內(nèi)注射AVP或Aβ25-35以及兩者聯(lián)合應(yīng)用對(duì)大鼠在體海馬CA1區(qū)神經(jīng)元自發(fā)放電的影響，旨在為AVP對(duì)抗Aβ的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)尋找電生理機(jī)制。

18、　　 方法：實(shí)驗(yàn)采用雄性Wistar大鼠，麻醉后將其固定在腦立體定位儀上，將三根綁定的金鼠記錄電極精確插入一側(cè)海馬CA1。然后打開放大器，開始觀察并記錄各處理組大鼠的在體胞外自發(fā)性單單位放電的模式和放電頻率。記錄的數(shù)據(jù)通過利用Spike sorting技術(shù)和Matlab軟件進(jìn)行分析。
　　 結(jié)論：Aβ25-35抑制了海馬神經(jīng)元的自發(fā)放電，而AVP能提高并且一定程度上對(duì)抗Aβ25-35對(duì)自發(fā)放電的傷害，提示大量單個(gè)細(xì)胞的放電和神