Liraglutide神經(jīng)保護作用的行為學(xué)和在體電生理研究.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是發(fā)生在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的一種慢性、原發(fā)性、不可逆性的神經(jīng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為進行性認知功能障礙、學(xué)習(xí)和記憶能力喪失，晚期出現(xiàn)嚴重癡呆。AD的一個典型病理特征是腦內(nèi)出現(xiàn)高密度的老年斑，其主要成分是淀粉樣β蛋白(Amyloidβ-protein，Aβ)。目前，Aβ的神經(jīng)毒性作用已有廣泛報道，如引起培養(yǎng)的神經(jīng)元凋亡、腦組織突觸可塑性下降和空間學(xué)習(xí)記憶行為的傷害等。因此，AD病因的“

2、Aβ學(xué)說”已被廣泛認可。然而，由于Aβ發(fā)揮神經(jīng)毒性作用的機制很復(fù)雜，迄今為止，其機制還不是很清楚且臨床上仍然缺乏有效對抗Aβ的藥物。因此，積極尋找能夠拮抗Aβ神經(jīng)毒性的藥物或治療手段對AD的預(yù)防和治療將具有十分重要的現(xiàn)實意義。
　　 近年來一個重要的發(fā)現(xiàn)是，AD與另外一種退行性疾病即Ⅱ型糖尿病(T2DM)在發(fā)病過程、病理變化、臨床表現(xiàn)和預(yù)后上有著驚人的相似。所以，有人把AD也稱為Ⅲ型糖尿病?；贏D與T2DM的相似性以及AD病因

3、的“Aβ學(xué)說”，近年來提出的一個治療AD的新策略就是：利用控制T2DM的于段干預(yù)AD，以減少Aβ的產(chǎn)生和聚集、拈抗Aβ的神經(jīng)毒性、增強Aβ的降解和清除。胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)是一種腸分泌的促胰島素分泌激素，由于其以葡萄糖依賴性方式促進胰島素的分泌，從而最大限度的減少血糖過低的危險，因而成為目前治療T2DM的最新藥物。GLP-1不儀可以刺激胰島β細胞增殖和再生、促進胰島素分泌、抑制

4、胰高血糖素釋放，也可以作用于中樞增強學(xué)習(xí)和記憶功能。有研究表明，包括海馬在內(nèi)的很多腦組織都有GLP-1及其受體(GLP-1R)的表達。還有實驗證實，GLP-1降低腦內(nèi)Aβ水平；發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)因子的作用，保護神經(jīng)元免受谷氨酸誘導(dǎo)的細胞凋亡；能夠有效阻止Aβ引起的海馬突觸可塑性即長時程增強(long term potentiation，LTP)的損傷。由于天然的GLP-1很不穩(wěn)定，在血液中的半衰期只有2-3分鐘，故本研究使用了GLP-1類似物

5、Liraglutide。目前Liraglutide已經(jīng)上市，可用來治療T2DM，其不僅半衰期較長，還具有較GLP-1更強的生物活性。然而，Liraglutide的神經(jīng)保護作用仍需要完整的在體和離體實驗證實。Liraglutide是否可以有效拮抗Aβ引起的認知功能傷害，是否能夠保護在體海馬突觸傳遞可塑性，目前仍然不清楚，其神經(jīng)保護作用的行為學(xué)和電生理研究也少有報道。因此，本研究采用行為學(xué)觀察和電生理記錄手段系統(tǒng)探討了GLP-1的神經(jīng)保護作

6、用及其可能機制。研究主要分為以下兩部分：(1)采用Morris水迷宮技術(shù)觀察了海馬注射Liraglutide對Aβ25-35誘導(dǎo)的大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力損傷的影響。(2)水迷宮實驗結(jié)束后，采用在體大鼠海馬CA1區(qū)場電位記錄方法，觀察了Liraglutide是否可以拮抗Aβ25-35誘導(dǎo)的晚期長時程增強(L-LTP)的損傷。
　　 第一部分：Liraglutide保護大鼠空間學(xué)習(xí)記憶免受Aβ25-35引起的損傷
　　 為闡明

7、Liraglutide在腦內(nèi)的神經(jīng)保護作用，我們采用經(jīng)典Morris水迷宮行為學(xué)方法觀察了雙側(cè)海馬注射Liraglutide對Aβ25-35誘導(dǎo)的大鼠空間、學(xué)習(xí)記憶功能傷害的神經(jīng)保護作用。本實驗選用反應(yīng)靈活、無視力和運動障礙的成年雄性Sprague Dawley(SD)大鼠，麻醉固定后在腦立體定位儀引導(dǎo)下，用微景注射泵將藥物緩慢注入雙側(cè)海馬，待動物清醒并恢復(fù)兩周后，進行Monrris水迷宮行為學(xué)測試。測試由三部分組成：定位航行實驗、空間

8、探索實驗和可視平臺實驗。主要觀察各種藥物處理對大鼠逃避潛伏期、游泳距離、大鼠處于目標象限（即平臺所在象限）所占的時間百分比和距離百分比，以及大鼠游泳速度的影響。
　　 實驗結(jié)果：(1)Aβ25-35能夠顯著降低大鼠的空間學(xué)習(xí)、記憶能力。雙側(cè)海馬注射4nmol Aβ25-35后，在定位航行實驗（隱藏平臺測試）中，與對照組相比，從訓(xùn)練的第2到5天，大鼠尋找水下平臺的時間和游過的距離明顯延長(P＜0.01)，例如，在第5天時，Aβ25

9、-35組大鼠逃避潛伏期和找到平臺所游過的距離分別為17.62±1.22s和262.93±28.85cm，明顯長于對照組的12.30±0.20cm和150.69±14.02cm(P＜0.01)。在空間探索實驗（第6天）中，Aβ25-35組的大鼠處于目標象限的時間占游泳總時間的百分比和距離百分比分別為為24.85±0.89％和23.30±2.06％，明顯短于對照組的44.79±1.61％和43.10±2.08％(P＜0.01)。(2) Li

10、raglutide單獨給予與對照組大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力無統(tǒng)計學(xué)差別。在定位航行實驗中,5nmolLiraglutide對大鼠逃避潛伏期和找到平臺所游過的距離無明顯影響，與對照組相比，沒有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異（p＞0.05）；在空間探索實驗中,5 nmol Liraglutide組大鼠處于目標象限的時間占游泳總時間的百分比和距離百分比分別為43.36±1.36％和44.93±0.79％，與對照組的44.79±1.61％和43.10±2.0

11、8％相比也無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。(3) Liraglutide劑量依賴性地保護了Aβ25-35誘導(dǎo)的大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力損傷。在定位航行實驗中，低劑量組Liraglutide(0.05 noml)預(yù)處理的大鼠逃避潛伏期和找到平臺所游過的距離與單獨給予Aβ25-35組無明顯差異(P＞0.05)；隨著Liraglutide濃度增加兩者均減小，且具有明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)。在訓(xùn)練的第5天，0.5 nmol和5 nmol Li

12、raglutide+Aβ25-35組大鼠逃避潛伏期分別為14.50±0.36 s(P＜0.05)和13.32±0.31s(P＜0.05)；逃避距離分別為200.47±8.64cm（P＜0.05）和188.87±12.34cm(P＜0.05)，呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性。在空間探索實驗中，0.5nmol和5nmol Liraglutide預(yù)處理組的大鼠處于目標象限的時間占游泳總時間的百分比分別為38.01±1.67％和43.22±0.93％，

13、距離百分比分別為37.76±1.56％和40.94±1.61％，明顯高于Aβ25-35單獨給予組(P＜0.01)，且隨著濃度的增加而逐漸增大，呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性。(4)可視平臺實驗顯示，Liraglutide和Aβ25-35的單獨使用及聯(lián)合應(yīng)用均未影響大鼠的視力和運動能力。各組游泳速度沒有明顯差異(P＞0.05)，基本維持在18cm/s。逃避潛伏期也沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，維持在14s左右。
　　 結(jié)論：雙側(cè)海馬注射

14、Aβ25-35嚴重損害了大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力，而Liraglutide卻劑量依賴性的拮抗了Aβ25-35引起的學(xué)習(xí)記憶能力損傷。該結(jié)果提示，腦內(nèi)GLP-1的高表達或使用GLP-1類似物L(fēng)iraglutide有可能在AD等神經(jīng)退行性疾病的預(yù)防和治療中起到積極的作用。
　　 第二部分：Liraglutide保護大鼠在體海馬晚期長時程增強免受Aβ25-35引起的損傷
　　 本實驗采用電生理手段記錄大鼠在體海馬場興奮性突觸后

15、電位(fieldexcitatory postsynaptic potential，fEPSP)，觀察了Aβ25-35和Liraglutide及二者聯(lián)合應(yīng)用對大鼠海馬CA1區(qū)晚期長時程增強(L-LTP)的影響，旨在探討Liraglutide拮抗Aβ25-35神經(jīng)毒性作用的電生理學(xué)機制。實驗采用水迷宮實驗后的SD大鼠，麻醉后固定于腦立體定位儀上，將自制的綁定電極（同心圓雙極刺激電極和單極記錄電極），精確插入到海馬的刺激及記錄部位。通過給予

16、海馬Schaffer側(cè)枝單個測試刺激、雙脈沖刺激及三組高頻刺激(high frequency stimulation，HFS)，在海馬CA1區(qū)放射層誘發(fā)和記錄基礎(chǔ)fEPSP、配對脈沖引起的雙脈沖易化(paired pulsefacilitation，PPF)以及HFSs引起的L-LTP。觀察各種藥物對基礎(chǔ)fEPSP、PPF及L-LTP的影響。
　　 實驗結(jié)果：(1)海馬注射Aβ25-35顯著抑制了高頻刺激引起的海馬在體L-LTP

17、。海馬注射4nmol Aβ25-35后，fEPSP平均幅度在HFSs后1h、2h和3h時分別為133.75±6.46％(P＜0.01)，118.70±4.05％(P＜0.01)和113.50±3.19％(P＜0.01)，明顯低于對照組的162.28±4.94％，159.24±1.85％和153.41±2.79％，表現(xiàn)出明顯的L-LTP抑制效應(yīng)。而單獨給予Liraglutide沒有明顯影響L-LTP幅度(P＞0.05)。(2)聯(lián)合應(yīng)用不同

18、濃度Liraglutide劑量依賴性拮抗了Aβ25-35誘導(dǎo)的海馬L-LTP損傷。給予HFSs后3h，不同濃度的Liraglutide(0.05，0.5和5 nmoI)+Aβ25-35組的fEPSP幅度分別為120.50±4.29％(P＞0.05)、140.84±4.81％(P＜0.05)和152.49±4.60％(P＜0.05)。其中，高濃度組(0.5和5 nmol)fEPSP幅度均明顯高于單獨給予Aβ25-35組的fEPSP幅度(P

19、＜0.05)，且隨著Liraglutide濃度的升高，Aβ25-35引起的L-LTP的壓抑效應(yīng)逐漸得到改善。(3)實驗中各組的PPF沒有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異，提示各種藥物影響L-LTP主要不是通過突觸前機制進行的。
　　 結(jié)論：Liraglutide預(yù)處理可劑量依賴性保護Aβ25-35引起的在體大鼠海馬CA1區(qū)L-LTP的損傷作用。Liraglutide對海馬L-LTP的保護效應(yīng)與Liraglutide存行為學(xué)上的作用基本保持一致，

20、可能部分地從細胞機制方面解釋了GLP-1塒大鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能的改善。
　　 總之，本研究利用Morris水迷宮和電生理場電位技術(shù)，通過觀察大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力及。記錄在體海馬L-LTP，探討了Liraglutide對抗Aβ25-35神經(jīng)毒性作用的效應(yīng)及可能電生理機制。結(jié)果顯示，Liraglutide能夠有效對抗Aβ25-35誘導(dǎo)的大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力和在體海馬L-LTP傷害，提示Liraglutide的神經(jīng)保護作用可能與其對突