NEP基因?qū)β-,25-35-誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷的保護作用及機制研究.pdf

1、研究目的：腦內(nèi)Aβ的病理積聚是啟動Alzheimer病(AD)長期病理級聯(lián)的關(guān)鍵事件。腦內(nèi)中性內(nèi)肽酶neprilysin(NEP)與AB的降解有關(guān)，老齡腦NEP活性降低，可能導(dǎo)致高毒性Aβ<,42>的聚集。為此，我們培養(yǎng)原代腦皮質(zhì)神經(jīng)元，通過基因轉(zhuǎn)染方法使之過表達NEP，在基因和蛋白質(zhì)兩個水平觀察NEP對神經(jīng)毒物質(zhì)Aβ<,25-35>誘導(dǎo)神經(jīng)細胞凋亡的保護作用，為Alzheimer病(AD)等退行性疾病尋求一種新的基因干預(yù)治療途徑。

2、 研究方法： (1)大腸桿菌的轉(zhuǎn)化，質(zhì)粒的擴增，提取及純化。 (2)質(zhì)粒的酶切及電泳鑒定。 (3)鼠腦原代神經(jīng)元培養(yǎng)及鑒定：取受孕第18天的胚鼠大腦皮層，剪碎，胰蛋白酶消化，離心計數(shù)，接種至培養(yǎng)板和培養(yǎng)瓶中，37℃，5﹪CO<,2>培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并用阿糖胞苷抑制非神經(jīng)細胞的增殖，純化神經(jīng)元，并對培養(yǎng)各階段的神經(jīng)細胞進行了觀察且系統(tǒng)地描述它們的形態(tài)特征，應(yīng)用微管相關(guān)蛋白2(MAP2)標記的免疫細胞化學方法鑒定神

3、經(jīng)元的純度。 (4)AB損傷細胞模型的制備：MTT法測細胞存活率，確定適當損傷細胞條件(Aβ<,25-35> 15μM，作用24小時)。 (5)神經(jīng)細胞轉(zhuǎn)染實驗：脂質(zhì)體法將含NEP基因的表達載體pcDNA3.1轉(zhuǎn)染培養(yǎng)原代神經(jīng)元。 (6)各種指標的檢測：通過電鏡觀察、MTT分析及流式細胞凋亡分析觀察NEP對于細胞生長的影響；以RT-PCR檢測目的基因mRNA水平的表達，Western-Blot測定檢測目的蛋白的

4、表達。研究結(jié)果：在神經(jīng)毒物質(zhì)Aβ<,25-35>作用下，MTT值及流式細胞分析法觀察神經(jīng)細胞較正常對照組出現(xiàn)明顯凋亡改變，而轉(zhuǎn)染NEP組神經(jīng)元活性顯著增高(P<0.05)，細胞凋亡率降低。RT-PCR及Western Blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染NEP組神經(jīng)元APP基因的表達明顯減少，Aβ的生成減少；同時促凋亡基因Bax表達降低，Bcl-2基因表達增高。 結(jié)論：一定劑量的Aβ<,25-35>能造成適當?shù)腁D病理性細胞損傷模型，通過外源