HSP60誘導(dǎo)免疫耐受抗動脈粥樣硬化的作用機(jī)制實驗研究.pdf

1、研究背景:
　　 熱休克蛋白60(heatshockprotein60，HSP60)是由受刺激以及死亡的內(nèi)皮細(xì)胞分泌和釋放的一種蛋白。動脈內(nèi)皮細(xì)胞受外界因素如應(yīng)激、高血壓、感染等刺激時可引起HSP60的表達(dá)，被樹突狀細(xì)胞、淋巴細(xì)胞所識別，從而觸發(fā)自身免疫反應(yīng)。近年來HSP60與動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)的關(guān)系越來越引起國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注，許多研究表明HSP60在AS發(fā)病中發(fā)揮重要作用，可作為自身抗原引發(fā)血

2、管壁的免疫反應(yīng)，啟動AS的形成并促進(jìn)AS進(jìn)一步發(fā)展。本課題將HSP60作為耐受原，從新角度研究口服HSP60誘導(dǎo)免疫耐受和抗AS的作用機(jī)制，對比AS造模前口服HSP60組（預(yù)防組）和造模后口服HSP60組（治療組）在誘導(dǎo)免疫耐受、抗AS及改善心肌缺血性損傷方面的異同點(diǎn)，探討口服HSP60的給藥時機(jī)，是否具有預(yù)防和治療雙重功效？為預(yù)防和治療AS和缺血性心臟病提供新策略。
　　 研究目的:
　　 1、探究口服HSP60誘導(dǎo)免

3、疫耐受具體機(jī)制（第一部分實驗要解決的研究問題）;
　　 2、探究口服HSP60抗動脈粥樣硬化機(jī)制（第二部分實驗要解決的研究問題）。
　　 研究方法:
　　 1、取出生后30天（1月齡）SD雄性大鼠40只，體重100±10g，隨機(jī)分為4組:健康對照組（C組），AS未干預(yù)組（AS組），AS造模前口服HSP60組（預(yù)防組，H1組），AS造模后口服HSP60組（治療組，H2組），以上每組10只;
　　 2、第一部

4、分實驗通過用免疫組化、流式細(xì)胞技術(shù)、ELISA法檢測上述四組大鼠主動脈、脾淋巴結(jié)組織和外周血CD4+、CD8+、IL-10、TGF-β及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)含量，評價口服HSP60誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫耐受的情況;
　　 3、第二部分實驗通過用酶比色法檢測各組血脂;經(jīng)HE染色后，用透射電鏡和圖像分析系統(tǒng)觀察各組主動脈及心肌病理改變，計算血管內(nèi)膜(intimalthickness，IT)與血管內(nèi)徑(innerdiameter，ID)之比

5、;用免疫組化、RT-PCR和Westernblot蛋白印跡法觀察、分析各組主動脈根部CD36、SR-A、NF-κB、HSP60表達(dá)及心肌VEGF和HIF-1α基因和蛋白表達(dá)情況;ELISA法檢測各組血清HSP60、MMP-9、hs-CRP含量。
　　 4、對各項指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，做相關(guān)性研究。從組織形態(tài)學(xué)、蛋白學(xué)、基因?qū)W、血清學(xué)、免疫學(xué)、超微結(jié)構(gòu)多角度研究口服HSP60誘導(dǎo)免疫耐受抗動脈粥樣硬化的具體機(jī)制。
　　 研究

6、結(jié)果:
　　 1、第一部分實驗結(jié)果:H1組和H2組CD8+抑制性T細(xì)胞、CD4+CD8+Foxp3+Treg細(xì)胞在外周血和脾淋巴組織中含量增加，Treg細(xì)胞分泌的具有抑制免疫、誘導(dǎo)免疫耐受的TGF-β和抑制特異性效應(yīng)T細(xì)胞的IL-1O等細(xì)胞因子在外周血中的含量也增加。相反，AS組上述指標(biāo)在降低，且各指標(biāo)相互之間均成正相關(guān)。CD4+輔助性T細(xì)胞含量在H1組和H2組表現(xiàn)為下降，在AS組表現(xiàn)為增加，與上述各指標(biāo)間成負(fù)相關(guān)。本實驗結(jié)果顯

7、示，口服HSP60能夠產(chǎn)生免疫耐受，且H1組較H2組誘導(dǎo)免疫耐受效果更好，提示越早口服HSP60誘導(dǎo)免疫耐受效果越好(P均＜0.05)。
　　 2、第二部分實驗結(jié)果:口服HSP60并不能降低血脂，但能減輕動脈內(nèi)膜增厚程度，且越早用藥效果越好;光鏡下AS組主動脈根部內(nèi)膜明顯較C組增厚，平滑肌細(xì)胞增生、排列紊亂，炎性細(xì)胞、泡沫細(xì)胞浸潤，肌纖維斷裂，可見動脈粥樣硬化斑塊;心肌組織也有相應(yīng)損傷性改變，心肌肌纖維結(jié)構(gòu)紊亂、肌細(xì)胞間隙增寬，

8、間質(zhì)水腫等，電鏡下可見心肌線粒體腫脹、線粒體嵴結(jié)構(gòu)紊亂、斷裂等。H1組和H2組血管及心肌病變程度較AS組為輕，且H1組病損輕于H2組，提示越早口服HSP60，抗動脈粥樣硬化效果越好;免疫組化、RT-PCR、Westernblot和ELISA檢測結(jié)果顯示，AS組主動脈HSP60、SR-A、CD36、NF-κB、心肌VEGF、HIF-1α基因蛋白表達(dá)及血清中HSP60、MMP-9、hs-CRP含量較對照組明顯增高，口服HSP60組能明顯降低

9、上述各指標(biāo)的表達(dá)程度，且H1組表達(dá)低于H2組，同樣提示越早口服HSP60，抗AS效果越好。相關(guān)性分析結(jié)果顯示:各組組內(nèi)血脂與血管IT/ID，主動脈和血清中HSP60與血管IT/ID，主動脈HSP60與其SR-A、CD36、NF-κB表達(dá)，血管IT/ID與主動脈SR-A、CD36、NF-κB表達(dá)，血脂與主動脈、血清HSP60，主動脈、血清HSP60含量與心肌VEGF、HIF-1α表達(dá)，血清HSP60含量與MMP-9、hs-CRP含量，主動

10、脈HSP60蛋白表達(dá)與主動脈SR-A、CD36、NF-κB、心肌HIF-1α、VEGFmRNA基因表達(dá)水平之間均存在正相關(guān)性（P均＜0.05）。
　　 研究結(jié)論:
　　 1、第一部分實驗結(jié)果表明，口服HSP60能夠誘導(dǎo)免疫耐受，其機(jī)理可能為:HSP60作為耐受原，經(jīng)口服與胃腸粘膜接觸，作用于腸道相關(guān)淋巴組織(GALT)中，刺激CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞增多，通過其分泌抑制性細(xì)胞因子IL-1O、TGF-β等

11、產(chǎn)生對HSP60抗原特異性的免疫耐受（無應(yīng)答或低應(yīng)答反應(yīng)），進(jìn)而可以減少局部免疫炎癥反應(yīng)，且越早期口服HSP60，越易誘導(dǎo)免疫耐受。
　　 2、第二部分實驗證明口服HSP60能夠抗AS，其機(jī)理是:口服HSP60誘導(dǎo)免疫耐受后，能夠①抑制動脈免疫炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為NF-κB、hs-CRP合量下降;②減少內(nèi)膜損傷及自身HSP60抗原的暴露，表現(xiàn)為主動脈HSP60表達(dá)、血清HSP60含量降低;③降低自身免疫反應(yīng)程度，從而減少血管內(nèi)膜增厚

12、程度，表現(xiàn)為血管IT/ID下降;④抑制平滑肌增生，表現(xiàn)為平滑肌清道夫受體SR-A基因及蛋白表達(dá)下降;⑤減少泡沫細(xì)胞和粥樣斑塊形成，表現(xiàn)為巨噬細(xì)胞CD36基因及蛋白表達(dá)下降，光鏡和電鏡下觀察斑塊明顯減少;⑥改善心肌供血，表現(xiàn)為心肌血管內(nèi)皮生長因子VEGF和乏氧誘導(dǎo)因子HIF-1α的基因和蛋白表達(dá)降低，光鏡和電鏡下見心肌病損減輕;⑦維持纖維斑塊的穩(wěn)定性，表現(xiàn)為血清基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9含量減低，降解斑塊纖維帽和動脈內(nèi)膜基質(zhì)、破壞斑塊完整性

13、和穩(wěn)定性能力下降。
　　 3、經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，口服HSP60耐受原具有預(yù)防和治療AS雙重功效，造模前和造模后口服HSP60，血管內(nèi)膜及平滑肌增生均減低，管腔狹窄均有不同程度改善，且造模前口服HSP60效果優(yōu)于造模后，即越早口服HSP60，抗AS效果越好。
　　 4、實驗亦發(fā)現(xiàn)僅僅依靠口服HSP60耐受原，并不能完全阻止和根治AS，口服HSP60組仍然存在血管內(nèi)膜和平滑肌增生現(xiàn)象，可能與口服HSP60只是誘導(dǎo)針對HSP60特異