間充質(zhì)干細胞不同單克隆神經(jīng)分化潛能的研究.pdf

1、間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)是存在于骨髓基質(zhì)中的一種多能干細胞，它包含不同的克隆亞群，這些克隆亞群之間在細胞形態(tài)、增殖能力和細胞功能上存在差異。單細胞克?。⊿ingle Cell Cloning，SSC）是由單個細胞不斷分裂擴增而形成一個更純的細胞群。建立MSCs的單細胞克隆，即形成MSCs的不同細胞亞群，非常適合于研究MSCs不同細胞亞群的生物特性和分化能力等方面的差異，是研究這些不同克隆亞群

2、之間差異的很好的模型。
　　 目前，MSCs移植用于治療疾病的報道已經(jīng)很多，但是MSCs療法普遍的問題是注射后能夠存留的細胞數(shù)量有限，細胞成活率卻較低。而這數(shù)量僅存的細胞只有極少量的分化為神經(jīng)細胞，這是治療效率低的一大瓶頸問題。在未來的研究和臨床治療應用中，我們渴望找到分化能力最強的克隆，這樣理想的克隆可以用來做優(yōu)良的種子細胞，將來利用克隆亞群針對性治療疾病對于治療效果的提高具有極其重要意義。
　　 然而，如何區(qū)分并篩選

3、出分化能力不同的MSCs克隆亞群？如果有這樣的區(qū)分亞群的標記物，那么問題就迎刃而解了。但是，在目前的研究水平，要精確的區(qū)分MSCs分化能力不同的亞群還不太可能，目前還沒有找到區(qū)分不同克隆亞群的標志物。
　　 我們選擇miRNA-9、Nestin和neuroD1作為研究指標，來研究MSCs不同克隆之間神經(jīng)方向分化潛能是否存在差異，以及miRNA-9對MSCs神經(jīng)分化潛能的影響。并探討是否可以用miRNA-9來作為神經(jīng)方向分化能力差

4、異的標記物，為今后的研究做鋪墊。
　　 實驗方法：
　　 一、MSCs的培養(yǎng)和單克隆制備
　　 培養(yǎng)全骨髓細胞，隨著換液和MSCs的增殖，可以得到純度95％以上的MSCs。原代MSCs傳代時，制備1/100μl細胞密度的細胞懸液，種植在96孔板中，每個孔加100μl細胞懸液，也就是每個孔有一個細胞，這一個細胞長成細胞集落，即是單克隆細胞群。
　　 二、不同單克隆miRNA-9、nestin和NeuroD1

5、的表達差異
　　 收集不同的克隆亞群，所收集的所有克隆miRNA-9的表達量的均值作為1，各個克隆miRNA-9的相對表達量與均值相比較得出。nestin和neuroD1的相對表達兩的計算也同樣。按照miRNA-9的相對表達量的差異，把收集的克隆分成三組。用Real-time PCR的方法檢測不同克隆miRNA-9、nestin和neuroD1的差異。并進行相關性分析。
　　 三、轉(zhuǎn)染miRNA-9前體，檢測轉(zhuǎn)染前后mi

6、RNA-9、nestin和neuroD1的變化情況
　　 MSCs轉(zhuǎn)染miRNA-9前體，轉(zhuǎn)染時間分為0h，24h，48h，96h。分析轉(zhuǎn)染前后和不同轉(zhuǎn)染時間miRNA-9、nestin和neuroD1的變化，研究miRNA-9對MSCs神經(jīng)方向分化的作用。
　　 實驗結(jié)果
　　 一、MSCs的培養(yǎng)和單克隆的制備
　　 原代培養(yǎng)24h后，小部分細胞貼壁，細胞梭形不明顯。48h后可見細胞集落。單細胞克隆第3

7、天時可見幾十個細胞的小集落。第5-7天集落鋪滿。不同的克隆生長速度和細胞形態(tài)之間有差異。
　　 二、不同單克隆miRNA-9、nestin和neuroD1的表達差異
　　 不同克隆miRNA-9、nestin和neuroD1的表達存在差異。Nestin是神經(jīng)前體細胞的標記物，neuroD1是神經(jīng)元的標記物，二者的總和記為nestin+neuroD1，可以作為MSCs向神經(jīng)方向分化的標記。相關性分析發(fā)現(xiàn)，miRNA-9與n

8、estin和neuroD1的總和正相關。
　　 三、轉(zhuǎn)染miRNA-9前體，檢測轉(zhuǎn)染前后miRNA-9、nestin和neuroD1的變化情況
　　 轉(zhuǎn)染后各時間段miRNA-9含量均比未轉(zhuǎn)染的MSCs miRNA-9含量增高。其中轉(zhuǎn)染24h miRNA-9含量最高，以后逐漸下降。轉(zhuǎn)染后各時間段nestin和neuroD1的表達量升高，其中72h表達量最高。說明miRNA-9能夠促進MSCs向神經(jīng)方向分化。