論文1：小型豬骨髓間充質(zhì)干細胞經(jīng)心導管冠狀動脈移植及其遷移和分化的實驗研究;論文2：骨髓間充質(zhì)干細胞多向分化潛能的實驗研究.pdf

1、目的 在建立小型豬骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymalstemceUs．MSCs)的體外分離和培養(yǎng)方法的基礎(chǔ)上探討小型豬心導管介入冠狀動脈治療模型，觀察自體MSCs經(jīng)心導管介入冠狀動脈移植后在心肌內(nèi)的遷移及分化情況，為MSCs移植治療心血管疾病提供切實可行的方法。 方法 選用心臟及冠狀動脈解剖生理特點與人類相似的小型豬，穿刺小型豬的髂后上嵴抽取骨髓，經(jīng)密度梯度法離心得到骨髓單個核細胞，接種后形成單層貼壁細胞，

2、通過換液和傳代純化MSCs，用形態(tài)學方法鑒定培養(yǎng)的MSCs。待MSCs擴增達到10?！?0。時，經(jīng)DAPI標記后應用心導管技術(shù)將體外培養(yǎng)擴增的小型豬自體MSCs移植進入左冠狀動脈前降支。用免疫熒光檢測即刻移植和移植后6w移植細胞的細胞肌鈣蛋白T(CardiacTroponinT，cTnT)、縫隙連接蛋白43(connexin43，Cx43)、anti一Ⅷfactor的表達。 結(jié)果 經(jīng)培養(yǎng)存活的MSCs原代和一代呈紡錘型、

3、多邊型或星型。至二代起呈均一紡錘型，似成纖維細胞樣，長寬比例約為2～3：1。體外培養(yǎng)的原代MSCs8～10d達到融合，傳代后仍具有較強的增殖能力。經(jīng)心導管介入冠狀動脈成功進行了自體MSCs移植，且移植細胞存活，MSCs自冠狀動脈移植處向心肌組織遷移，分散分布；部分MSCs向心肌細胞方向分化，局部心肌組織出現(xiàn)新生毛細血管；未見炎癥及排斥反應。對照即刻組MSCs聚集成團狀，未有遷移及分化出現(xiàn)。 結(jié)論 小型豬MSCs可在體外分

4、離、純化、擴增；應用心導管術(shù)進行自體MSCs移植成功，并可進行準確的定位和動態(tài)觀測，為臨床應用提供了一個可靠的技術(shù)平臺。自體移植后的MSCs在心肌內(nèi)存活，并且在多種因素的作用下可以從移植處向心肌組織內(nèi)遷移，部分細胞發(fā)生分化。 目的 體外以成年Wistar大鼠為研究對象，觀察5一氮雜胞苷(5-azacyt塒ine，5-aza)誘導MSCs分化為心肌樣細胞的分化率以及MSCs向神經(jīng)細胞和骨細胞分化的情況，確認MSCs

5、含有不同組織類型的定向干細胞。 方法 以成年Wistar大鼠為研究對象，體外分離、純化、培養(yǎng)大鼠MSCs，將原代MSCs接種在裝有蓋玻片的細胞培養(yǎng)板中，待細胞鋪滿玻片90％～95％后，用5-aza(終濃度為10umol／L)誘導24h。DAPI標記細胞，每張爬片隨機選取6個非重復視野，用免疫熒光方法動態(tài)檢測誘導前及誘導后24h、3d、1w、2w、4w的cTnT、Cx43的表達。同時建立空白對照組(培養(yǎng)基中不加誘導劑)，c

6、TnT、Cx43。設(shè)立實驗對照組，與誘導組同一時間點動態(tài)檢測巢蛋白(Nestin)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NeuronSpecificEndolase，NSE)、I型膠原蛋白(CollagenTypeI，CTI)的表達，用改良Kaplow氏法檢測細胞內(nèi)堿性磷酸酶(intra—cellularalkalinephosphatases，CAKP)的表達，分別計算cTnT、Cx43、Nestin、NSE、CTI、CAKP的表達百分比及其變化情

7、況，并在倒置顯微鏡下觀察誘導前后細胞形態(tài)的變化及對照組細胞形態(tài)的變化。 結(jié)果 體外實驗中，誘導后細胞胞體增長，胞漿增多，有多個分叉，形態(tài)和個數(shù)各不相同，細胞之間出現(xiàn)連接，細胞排列趨向一致，但未觀察到自發(fā)搏動，cTnT在誘導前及誘導后24h、3d、1w、2w、4w的平均表達率依次為0、2．9％、8．5％、11．8％、22．2％、32．6％；Cx43在誘導前及誘導后24h、3d、1w、2w、4w的平均表達率依次為O、3．9％

8、、8．1％、16．4％、23．6％、34．6％。空白對照組(未誘導)中只有少量細胞形態(tài)上胞體增長，出現(xiàn)分叉，呈現(xiàn)心肌樣細胞特點，cTnT的平均表達率依次為：O、0、O、2．1％、4．1％、6．6％；Cx43的平均表達率依次為：O、0、0、2．2％、4．1％、7．1％；實驗對照組中少量細胞形態(tài)上呈圓形，立題感增強，有突觸出現(xiàn)，呈現(xiàn)神經(jīng)樣細胞特點，Nstin的平均表達率依次為0、0、0、2．7％、5．2％、6．9％；NSE的平均表達率依次為

9、O、0、0、L7％、2．8％、6．5％；少量細胞形態(tài)上多邊形，連接緊密，胞體立方形或矮柱狀形，表面有許多細小突起，呈現(xiàn)骨樣細胞特點，I型膠原蛋白的平均表達率依次為0、0、0、1．9％、3．9％、6．2％，CAKP的平均表達率依次為0、0、O、O、1．9％、4．4％。 結(jié)論 MSCs是非均質(zhì)性的，其中可能含有不同分化方向的干細胞亞群，即含有向不同組織細胞分化的定向干細胞群，其具有潛在的分化為相應組織細胞的能力。