表阿霉素、米托蒽醌及5-氟尿嘧啶對(duì)B16細(xì)胞膜表面鈣網(wǎng)蛋白表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：探討腫瘤化療藥物表阿霉素（EPI）、米托蒽醌（MIT）及5-氟尿嘧啶（5-FU）對(duì)小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16膜表面免疫原性相關(guān)蛋白——鈣網(wǎng)蛋白（calreticulin，CRT）表達(dá)量的影響，尋找能夠使細(xì)胞表面CRT有效表達(dá)的理想藥物濃度，為建立化療誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞免疫治療新方法提供理論支持和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
　　 方法：用CCK-8法檢測EPI、MIT、5-FU對(duì)B16細(xì)胞的生長抑制效應(yīng)；用流式細(xì)胞儀檢測不同濃度EPI、MIT、5-

2、FU作用于B16細(xì)胞24h后細(xì)胞膜表面的CRT表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.CCK-8檢測結(jié)果：EPI、MIT、5-FU三組藥物對(duì)B16細(xì)胞增殖的抑制率均隨著藥物濃度的增加而加大。其24h的半數(shù)抑制濃度值（IC50）分別為：EPI組1.6ug/ml，MIT組1.0ug/ml，5-FU組50ug/ml。
　　 2.濃度為IC50的3種藥物對(duì)B16細(xì)胞膜表面CRT表達(dá)的影響：用0.01mol/L PBS、1.6ug

3、/ml EPI、1.0ug/ml MIT、50ug/ml5-FU干預(yù)B16細(xì)胞24h后，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面CRT的表達(dá)量，相應(yīng)的平均熒光強(qiáng)度分別為：PBS組，58.27±3.66；EPI組，250.98±9.94；MIT組，110.76±6.76；5-FU組，155.96±6.95。3種化療藥物均能有效誘導(dǎo)鈣網(wǎng)蛋白在細(xì)胞膜表達(dá)增加，各組分別與對(duì)照組兩兩相比，均有顯著性差異（P值均小于0.001）。其中，以表阿霉素的作用最強(qiáng)，其次為5

4、-氟尿嘧啶，米托蒽醌作用相對(duì)最弱。
　　 3.藥物在不同濃度對(duì)B16細(xì)胞膜表面CRT表達(dá)的影響：①隨著表阿霉素濃度的增加，CRT的平均熒光強(qiáng)度也逐漸增高，與PBS對(duì)照組相比較有顯著性差異（P值均小于0.001）；各濃度組間兩兩比較，也有顯著性差異（P值均小于0.001）。②隨著米托蒽醌濃度的增加，CRT的平均熒光強(qiáng)度也逐漸增高；當(dāng)達(dá)到8×IC50時(shí)，CRT表達(dá)不再增加，反而降低。各濃度組與PBS對(duì)照組相比較均有顯著性差異（P值均

5、小于0.001）；各濃度組間兩兩比較，除4ug/ml與8ug/ml組比較，無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.377>0.05）外，其余濃度組間兩兩比較，均有顯著性差異（P值均小于0.01）。③隨著5-氟尿嘧啶濃度的增加，CRT的平均熒光強(qiáng)度逐漸增高。各濃度組與PBS對(duì)照組相比較均有顯著性差異（P值均小于0.001）；各濃度組間兩兩比較，除200ug/ml與400ug/ml組相比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.189>0.05）外，其余濃度組間兩兩比較

6、，均有顯著性差異（P值均小于0.001）。
　　 結(jié)論：
　　 1.以往研究認(rèn)為只有表阿霉素、米托蒽醌等蒽環(huán)類藥物能通過誘導(dǎo)CRT膜轉(zhuǎn)位促進(jìn)腫瘤細(xì)胞免疫原性死亡，本研究發(fā)現(xiàn)，5-氟尿嘧啶也能促使B16細(xì)胞膜表面鈣網(wǎng)蛋白表達(dá)增多，說明應(yīng)該還存在其它細(xì)胞毒性藥物，也能夠通過誘導(dǎo)鈣網(wǎng)蛋白膜轉(zhuǎn)位來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的免疫原性死亡。進(jìn)一步擴(kuò)大篩選這類誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞免疫原性死亡的化療藥物，對(duì)提高腫瘤免疫治療的療效具有重要意義。
　　

7、 2.盡管化療藥物的濃度和鈣網(wǎng)蛋白在細(xì)胞膜表面的表達(dá)量有一定濃度依賴性，能夠刺激鈣網(wǎng)蛋白最佳表達(dá)的最低化療藥物濃度，更具有實(shí)際的臨床應(yīng)用價(jià)值，但有待進(jìn)一步動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。
　　 本研究的結(jié)果提示：包括蒽環(huán)類、5-氟尿嘧啶在內(nèi)的一些化療藥物能夠有效誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞表面鈣網(wǎng)蛋白的表達(dá)，盡管這一現(xiàn)象的詳細(xì)機(jī)制尚不清楚，但鈣網(wǎng)蛋白膜轉(zhuǎn)位能夠誘使抗原提呈細(xì)胞對(duì)凋亡或壞死的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行吞噬，進(jìn)而誘發(fā)有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答，這一過程已被實(shí)驗(yàn)證