昆蟲核型多角體病毒的增效途徑和機理.pdf

1、昆蟲核型多角體病毒(NPV)作為生物殺蟲劑，除了具有對天敵安全、不污染環(huán)境和不易產(chǎn)生抗藥性等生物農(nóng)藥普遍存在的優(yōu)點外，更因其能在害蟲種群中形成流行病而長期控制蟲口這一明顯優(yōu)于其它殺蟲劑的特點而受到人們的廣泛關(guān)注。但NPV也存在殺蟲范圍窄和作用速度慢等缺點，這大大限制了其在生產(chǎn)上的應(yīng)用。因此，研究提高其殺蟲活性的途徑和機理對于開發(fā)實用性病毒制劑是至關(guān)重要的。 目前對NPV的增效途徑和增效機理已有不少研究報道，但斜紋夜蛾NPV(SI

2、NPV)尚很少研究。斜紋夜蛾和甜菜夜蛾食性雜，食量大，繁殖力強，是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的重要害蟲，已對許多化學(xué)農(nóng)藥產(chǎn)生了抗性，SINPV是具有潛力的替代生物防治劑。因此，本文以斜紋夜蛾和甜菜夜蛾為靶標(biāo)對象，研究提高SINPV毒力的增效途徑和增效機理，以促進SINPV在害蟲防治上的開發(fā)應(yīng)用。 一、核型多角體病毒增效途徑研究本研究通過測定不同病毒種和分離株之間復(fù)合侵染的增毒作用、交替感染不同寄主對毒力的影響、以及生長調(diào)節(jié)劑類殺蟲劑對病毒的增效

3、作用，尋找提高NPV毒力效果的途徑。研究結(jié)果如下： (1)不同種病毒間的聯(lián)合增效作用研究表明，八字地老虎顆粒體病毒(XcGV)可明顯提高核型多角體病毒(NPV)的毒力。在以斜紋夜蛾為靶標(biāo)對象時，XcGV可提高斜紋夜蛾NPV(SINPV)對3齡幼蟲的殺蟲速度，害蟲的致死中時間(LT50)縮短了0.5-2.5d，還可同時提高SINPV對5齡幼蟲的殺蟲速度和殺蟲活性，害蟲的死亡率提高了33.8％；此外，聯(lián)合作用于5齡幼蟲時還明顯抑制了

4、斜紋夜蛾體重的增長。以甜菜夜蛾為靶標(biāo)對象時，XcGV可提高XcNPV和SINPV對2齡幼蟲的殺蟲速度，LT50縮短1.3-1.7d。 (2)SINPV不同分離株間的增效作用研究發(fā)現(xiàn)，斜紋夜蛾核型多角體病毒(SINPV)日本福岡株、小笠原株和埃及株感染斜紋夜蛾，在種群中連續(xù)傳代的過程中，各分離株單獨及復(fù)合侵染對斜紋夜蛾的毒力均發(fā)生了明顯變化。單獨侵染連續(xù)傳代后，各分離株毒力顯著提高，但不同分離株毒力提高的程度不同。F0代時以福岡株

5、的毒力最高，埃及株次之，小笠原株最低，在F1代，以小笠原株毒力最高，福岡株次之，埃及株最低，而在F2代，小笠原株和埃及株的毒力變得高于福岡株，但到F3代，3個分離株的毒力無顯著差異。復(fù)合侵染連續(xù)傳代時，在F0代和F1代日本福岡株和小笠原株以及小笠原株和埃及株兩兩復(fù)合侵染均顯著增效，但福岡株和埃及株間以及三個分離株同時復(fù)合侵染均具有拮抗作用，在F2代和F3代，除F2代時小笠原株和埃及株外，其余各復(fù)合侵染也均具有拮抗作用。 (3)宿

6、主對病毒毒力效果的影響選用對甜菜夜蛾較?；能俎ｃy紋夜蛾NPV(AcNPV)和對斜紋夜蛾較?；腟INPV，研究了混合病毒在不同宿主中交替繁殖對病毒毒力的影響。兩種病毒以1∶1混合后，分別連續(xù)感染或交替感染甜菜夜蛾和斜紋夜蛾，比較測定各代病毒對甜菜夜蛾和斜紋夜蛾的活性，結(jié)果表明，SINPV中國株和AcNPV混合，起始感染甜菜夜蛾，再在斜紋夜蛾和甜菜夜蛾中交替繁殖后，F(xiàn)4代從斜紋夜蛾中分離的病毒對3齡甜菜夜蛾幼蟲的致死率極顯著高于F2代斜

7、紋夜蛾中分離的病毒，F(xiàn)3代從甜菜夜蛾中分離的病毒對斜紋夜蛾的致死率也顯著高于F1代甜菜夜蛾中分離的病毒。起始感染斜紋夜蛾，經(jīng)甜菜夜蛾和斜紋夜蛾中交替繁殖后，斜紋夜蛾中分離的病毒對甜菜夜蛾的毒力以及甜菜夜蛾中分離的病毒對斜紋夜蛾的毒力也都顯著提高。同時，交替寄主傳代后的病毒比同代次同種寄主連續(xù)傳代后的病毒對非宿主的毒力顯著提高，并且它們對原宿主的毒力未有減弱。AcNPV和SINPV日本株混合病毒在甜菜夜蛾和斜紋夜蛾中交替繁殖后也表現(xiàn)出對非

8、宿主毒力的提高。這表明混合病毒在不同宿主中交替繁殖比其在同種宿主中連續(xù)繁殖后對非繁殖原宿主的毒力提高。 (4)米滿和氟啶脲對病毒的增效作用研究證明昆蟲幾丁質(zhì)合成抑制劑氟啶脲對NPV有顯著增效作用。氟啶脲和AcNPV聯(lián)合作用時，可提高病毒對3齡幼蟲的殺蟲活性和殺蟲速度，對害蟲的致死中濃度(LC50)和LT50分別下降83％和11％。氟啶脲和AcNPV聯(lián)合作用還顯著抑制了甜菜夜蛾幼蟲的生長發(fā)育，幼蟲體重增長明顯低于單用病毒處理的幼蟲

9、。氟啶脲和SINPV聯(lián)合作用于5齡斜紋夜蛾幼蟲時，病毒的殺蟲活性和殺蟲速度分別提高了139.8％和5％。 昆蟲蛻皮激素拮抗劑米滿對AcNPV增效作用的測定結(jié)果表明，米滿可顯著提高AcNPV對甜菜夜蛾的殺蟲毒力和殺蟲速度。作用于3齡和4齡幼蟲時，6.67mg/L米滿對AcNPV的增效比分別是1.31和3.62，使害蟲LT50分別縮短25％和20.4％。米滿和病毒協(xié)同作用還顯著抑制了幼蟲的生長發(fā)育，在協(xié)同作用1天后，幼蟲體重即顯著低

10、于單用病毒或?qū)φ仗幚淼挠紫x，并且隨著作用時間的延長，協(xié)同作用組幼蟲體重同病毒單劑組及對照組的差異越來越大。但6.67mg/L米滿和2.7×105PIB/mlAcNPV協(xié)同作用于幼蟲期時，其對存活幼蟲發(fā)育為成蟲后的繁殖力無影響，成蟲產(chǎn)卵量、交配率、卵孵率以及卵孵化幼蟲數(shù)等均與病毒單劑、米滿單劑和對照無顯著差異。 二、病毒增效機理研究本研究通過靶標(biāo)試蟲的組織觀察和病毒基因組DNA分析，對病毒不同增效途徑的機理進行了研究，結(jié)果如下：

11、 (1)病毒增效作用與昆蟲圍食膜破壞的關(guān)系通過環(huán)境掃描電鏡(ESEM)觀察了XcGV在活體中對斜紋夜蛾圍食膜結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果表明，正常的斜紋夜蛾圍食膜表面光滑、致密，除細(xì)小的皺褶外，沒有孔和裂紋；SINPV單獨作用后圍食膜表面凹凸不平，但仍較為致密，并且也沒有孔隙和裂紋；而XcGV在活體內(nèi)單獨作用2h后圍食膜結(jié)構(gòu)變得疏松，在XcGV和SINPV協(xié)同作用2h后，圍食膜表面亦變得疏松，并且出現(xiàn)一些孔隙和縫。說明XcGV破壞了昆蟲圍食膜

12、，使其對NPV的通透性增加，從而提高了SINPV的侵染力。由此表明XcGV對昆蟲圍食膜的破壞作用是其對NPV增效的重要機理。 環(huán)境掃描電鏡觀察結(jié)果還表明，昆蟲生長調(diào)節(jié)劑氟啶脲也對斜紋夜蛾圍食膜產(chǎn)生了強烈的破壞作用。2.5mg/L的氟啶脲處理2h后，斜紋夜蛾5齡幼蟲的圍食膜出現(xiàn)明顯的裂縫，混合處理組斜紋夜蛾也出現(xiàn)裂縫，并且有許多孔洞。表明氟啶脲對斜紋夜蛾核多角體的增效作用與其對昆蟲圍食膜的破壞作用有關(guān)。進一步研究圍食膜的幾丁質(zhì)含量

13、，發(fā)現(xiàn)氟啶脲和NPV聯(lián)合作用后，斜紋夜蛾圍食膜幾丁質(zhì)的含量極顯著下降，表明氟啶脲對NPV的增效作用是由于其對圍食膜幾丁質(zhì)的破壞作用引起的。 病毒增效作用與昆蟲病毒基因型的關(guān)系通過活體克隆法研究分析了SINPV各分離株F0代病毒基因型。在獲得了低劑量下感染SINPV日本福岡株、日本小笠原株和埃及株F0代病毒的斜紋夜蛾病蟲后，分離病毒，比較各單頭病蟲中病毒對斜紋夜蛾和甜菜夜蛾的毒力，并對病毒的基因型進行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三個分離株感染

14、后，單頭病蟲中分離的病毒均存在表型差異，不僅對斜紋夜蛾的侵染力不同，而且侵染速度也有差異，侵染力和侵染速度間無明顯相關(guān)性，另外各病毒對甜菜夜蛾的毒力也存在差異。 本研究還表明，SINPV和AcNPV混合在甜菜夜蛾和斜紋夜蛾中交替繁殖后，病毒毒力提高與病毒基因型的變異相關(guān)。SINPV中國株和AcNPV中國株以1∶1混合感染斜紋夜蛾后，再經(jīng)甜菜夜蛾和斜紋夜蛾中交替繁殖1次，最終由斜紋夜蛾中獲得的病毒DNA酶切圖譜較連續(xù)在斜紋夜蛾中繁

15、殖的病毒酶切圖譜發(fā)生了變化，而一直在斜紋夜蛾中連續(xù)傳代的各代次病毒酶切圖譜未有變化。SINPV日本福岡株和AcNPV中國株混合感染甜菜夜蛾后，再感染斜紋夜蛾，得到的斜紋夜蛾病毒再交替感染甜菜夜蛾和斜紋夜蛾，亦發(fā)現(xiàn)交替繁殖2次后從斜紋夜蛾中分離的病毒限制性酶切圖譜較交替繁殖1次后的病毒酶切圖譜有變化。 綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)XcGV對SINPV、以及具有基因型差異的SINPV分離株之間，具有明顯的增毒作用；甜菜夜蛾和斜紋夜蛾等不同宿

16、主的交叉感染可以拓展病毒的有效防治靶標(biāo)范圍；昆蟲生長調(diào)節(jié)劑類殺蟲劑氟啶脲和米滿，對SINPV也有明顯的增效作用。其中GV和氟啶脲對NPV的增效作用機制，主要是他們可以破壞斜紋夜蛾幼蟲的圍食膜；而不同分離株之間的增效作用則可能與不同基因型之間的互補效應(yīng)有關(guān)；交替感染不同宿主提高病毒對不同宿主毒力的主要原因，可能是由于病毒在交替感染過程中的基因型變異造成的。 本研究發(fā)現(xiàn)的病毒增效途徑，可以用于開發(fā)高效的病毒制劑，研究揭示的增效機理，