家蠶核型多角體病毒幾丁質(zhì)基因的克隆表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物對(duì)Bt殺蟲(chóng)劑的增效作用.pdf

1、桿狀病毒是鱗翅目昆蟲(chóng)重要的病原微生物,在農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)防治中具有很大的應(yīng)用前景.同時(shí)桿狀病毒-昆蟲(chóng)(蟲(chóng)體)表達(dá)系統(tǒng)是最近發(fā)展起來(lái)的高效表達(dá)外源基因的真核表達(dá)系統(tǒng).因此桿狀病毒近年倍受重視,相關(guān)的分子生物學(xué)研究得到迅速發(fā)展.該論文應(yīng)用現(xiàn)代分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)對(duì)家蠶核型多角體病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)幾丁質(zhì)酶基因進(jìn)行表達(dá)和表達(dá)產(chǎn)物對(duì)Bt殺蟲(chóng)劑的增效作用的研究.1、從基因組擴(kuò)增了BmNP

2、V幾丁質(zhì)酶全部編碼區(qū)基因(chiA)和BmNPV缺失假定信號(hào)肽的幾丁質(zhì)酶的編碼區(qū)基因(chis-).將chi按其閱讀框構(gòu)建到pET28a原核表達(dá)載體T7強(qiáng)啟動(dòng)子下,得到pETchiA重組質(zhì)粒.再將pETchiA轉(zhuǎn)入大腸桿菌DE3中誘導(dǎo)進(jìn)行融合表達(dá),通過(guò)SDS-PAGE及Western印跡檢測(cè),確定表達(dá)出分子量為64 kD左右的蛋白.薄層掃描顯示,表達(dá)產(chǎn)物占細(xì)胞總蛋白的22％.2、將PCR擴(kuò)增出的BmNPV chis-基因構(gòu)建到桿狀病毒-

3、昆蟲(chóng)(Bac-to-Bac)表達(dá)系統(tǒng)的供體質(zhì)粒pFASTBACHTb中,目的基因構(gòu)建在多角體蛋白基因強(qiáng)啟動(dòng)子控制下,并與6×His tag融合表達(dá).通過(guò)轉(zhuǎn)座作用將目的基因重組進(jìn)穿梭載體Bacmid中,重組Bacmidchis-DNA在Lipofectin介導(dǎo)下共轉(zhuǎn)染粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)細(xì)胞系(Tn-5B1-4).連續(xù)傳代感染四次后,經(jīng)PCR檢測(cè)鑒定轉(zhuǎn)染成功的重組病毒含有目的基因.對(duì)感染細(xì)胞進(jìn)行SDS-PAGE分析及

4、Western印跡檢測(cè),表明有特異性表達(dá)條帶,其分子量為63kD左右.薄層掃描顯示,表達(dá)產(chǎn)物占細(xì)胞總蛋白的12％.3、將以上BmNPV幾丁質(zhì)酶全部編碼區(qū)基因(chiA)在大腸桿菌和BmNPV缺失假定信號(hào)肽的幾丁質(zhì)酶的編碼區(qū)基因(chis-)在昆蟲(chóng)細(xì)胞中的兩種表達(dá)產(chǎn)物分別加入Bt菌液中一起喂食2齡家蠶,觀察并記錄不同處理?xiàng)l件下家蠶的死亡時(shí)間及死亡時(shí)的體重,測(cè)算出其LT<,50>和LT<,90>值.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,取食了添加BmNPV表達(dá)產(chǎn)物