SIRT1通過抑制p66shc改善高血糖導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞功能失常及預(yù)防血管衰老的發(fā)生.pdf

1、由于糖尿病的患病人數(shù)急速增加，糖尿病及并發(fā)癥已成為十分嚴(yán)峻的公共衛(wèi)生問題。糖尿病導(dǎo)致的心血管并發(fā)癥是糖尿病致死致殘的最主要原因。作為血管屏障的內(nèi)皮細(xì)胞對血管功能起著極其重要的調(diào)節(jié)作用，高血糖通過氧化應(yīng)激造成的內(nèi)皮細(xì)胞功能失常及血管衰老是糖尿病血管并發(fā)癥的主要發(fā)病原因之一。因此，對高血糖情況下內(nèi)皮細(xì)胞功能失常及血管衰老的研究，為糖尿病心血管并發(fā)癥的防治提供了方向。
　　 SIRT1是哺乳動物中依賴于NAD+的Ⅲ類組蛋白去乙?；福?/p>

2、是低等動物中Sir2的同源物，在許多生命過程，如細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、DNA損傷修復(fù)、長壽和基因沉默中都發(fā)揮了重要的作用。SIRT1能夠去乙?；疐OXO并且促進(jìn)它的活性，因此具有抗氧化應(yīng)激的能力。雖然大量研究認(rèn)為SIRT1介導(dǎo)了能量限制(CR)的長壽效應(yīng)，但SIRT1在細(xì)胞衰老中的作用卻存在爭議，而SIRT1在組織衰老中的作用還沒有報道。p66shc是介導(dǎo)氧化應(yīng)激和凋亡的重要分子，p66shc-/-鼠不僅氧化應(yīng)激水平降低，壽命明顯延長，還

3、能抵御高血糖引起的內(nèi)皮細(xì)胞功能失常；p66shc-/-鼠的心肌祖細(xì)胞(CPC)能抵抗高糖引起的細(xì)胞衰老。因此我們推測：在內(nèi)皮細(xì)胞過表達(dá)SIRT1可以保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞，抵御高血糖引發(fā)的氧化應(yīng)激導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞功能失常，防止血管衰老的發(fā)生，其機(jī)制可能與p66shc相關(guān)。
　　 首先，我們檢測了正常和患有糖尿病的C57鼠以及2個月和18個月的C57小鼠主動脈中SIRT1的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)糖尿病及衰老時小鼠主動脈中SIRT1的表達(dá)水平顯著降低；

4、為了研究SIRT1在糖尿病血管損傷中的作用，選用實(shí)驗(yàn)室己建立的SIRT1內(nèi)皮特異的轉(zhuǎn)基因小鼠（陽性鼠和陰性鼠），通過腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)的方法建立了工型糖尿病模型。注射STZ2個月后，血管環(huán)張力實(shí)驗(yàn)證明SIRT1過表達(dá)改善了糖尿病導(dǎo)致的內(nèi)皮功能失常，免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)SIRT1過表達(dá)抑制了糖尿病導(dǎo)致的8-OH-dG和nitrotyrosine水平的升高，降低了血管的氧化應(yīng)激水平；取患有2個月糖尿病的小鼠的主動脈，用Western

5、blotting檢測發(fā)現(xiàn)SIRT1過表達(dá)能降低p66shc的蛋白表達(dá)水平，升高抗氧化應(yīng)激分子MnSOD水平，但對p53、p21和PAI-1等衰老標(biāo)志的水平無顯著影響，說明這個階段SIRT1主要是改善內(nèi)皮功能失常。進(jìn)而我們在細(xì)胞水平探討了SIRT1調(diào)節(jié)p66shc的機(jī)制。在人原代內(nèi)皮細(xì)胞中過表達(dá)SIRT1能降低高糖誘導(dǎo)的p66shc的mRNA和蛋白的表達(dá)。ChIP證實(shí)SIRT1結(jié)合p66shc的promoter上（-276bp至-535b

6、p），過表達(dá)SIRT1可以降低p66shc的promoter組蛋白H3的乙?；健Ａ硗?，我們發(fā)現(xiàn)在患有工型糖尿病模型小鼠主動脈中，SIRT1轉(zhuǎn)基因鼠與野生型鼠相比，H3的乙?；揭诧@著降低。能量限制12個月的模型小鼠主動脈中SIRT1水平升高，p66shc表達(dá)水平降低，進(jìn)一步證明SIRT1能降低p66shc的表達(dá)，提示SIRT1能防止血管衰老。接著我們在HUVECs中通過SA-β-gal染色發(fā)現(xiàn)過表達(dá)SIRT1對高糖刺激引起的人原代

7、內(nèi)皮細(xì)胞衰老有保護(hù)作用，而抑制SIRT1能促進(jìn)高糖刺激引起的人原代內(nèi)皮細(xì)胞衰老。由此我們將工型糖尿病模型造模時間延長到了10個月。Ⅰ型糖尿病模型小鼠10個月時，主動脈中SIRT1過表達(dá)能降低p66shc的水平，同時降低p53、p21和PAI-1等衰老標(biāo)志的表達(dá)水平，這說明SIRT1可能通過抑制p66shc表達(dá)，改善內(nèi)皮功能失常，進(jìn)而防止血管衰老的發(fā)生。最后，我們在18個月的轉(zhuǎn)基因小鼠主動脈中檢測了p66shc和衰老相關(guān)分子的的蛋白表達(dá)變

8、化。我們發(fā)現(xiàn)：18個月大的SIRT1轉(zhuǎn)基因鼠與野生型鼠相比，SIRT1轉(zhuǎn)基因鼠主動脈中p66shc顯著降低，同時也發(fā)現(xiàn)p53、p21和PAI-1等衰老相關(guān)分子的蛋白水平顯著降低，進(jìn)一步為證實(shí)SIRT1能降低p66shc的表達(dá)，防止血管衰老提供證據(jù)，還提示SIRT1可以抑制年齡依賴的動脈衰老。
　　 結(jié)論：我們首次發(fā)現(xiàn)p66shc是SIRT1的一個新的下游分子，SIRT1與p66shc的啟動子結(jié)合，通過去乙?；M蛋白H3而下調(diào)p6

9、6shc的表達(dá)水平；在內(nèi)皮細(xì)胞中，SIRT1可能通過降低p66shc的表達(dá)水平，對氧化應(yīng)激引起的內(nèi)皮細(xì)胞衰老起到了保護(hù)作用；在工型糖尿病模型中，SIRT1內(nèi)皮細(xì)胞特異的轉(zhuǎn)基因可能通過降低p66shc的表達(dá)，降低了血管的氧化應(yīng)激水平，改善了內(nèi)皮細(xì)胞的功能，預(yù)防動脈衰老的發(fā)生，并且SIRT1還抑制年齡依賴的動脈衰老。
　　 心臟病專家和絕大多數(shù)內(nèi)科醫(yī)生認(rèn)為衰老是人類患動脈粥樣硬化的一個獨(dú)立危險因數(shù)，因此動脈粥樣硬化常被看作人類衰老的

10、重要特征。最近應(yīng)用多種動物模型進(jìn)行的基因分析證實(shí)有一些分子對于衰老是至關(guān)重要的。這些分子包括參與DNA損傷修復(fù)，腫瘤抑制，端粒維護(hù)，insulin/AKT通路以及其他代謝途徑的分子，其中絕大多數(shù)的分子不僅可以影響機(jī)體衰老的表型，還可以直接調(diào)節(jié)細(xì)胞的衰老，提示細(xì)胞衰老與機(jī)體衰老間存在因果聯(lián)系。例如，DNA修復(fù)功能缺陷可引起類似早衰的表型，在衰老細(xì)胞中更容易出現(xiàn)DNA損傷的累積；過多的能量攝入能引起糖尿病和高胰島素血癥，而體外實(shí)驗(yàn)表明胰島素