FGF21通過鈍化內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激改善低氧肺動脈內(nèi)皮細胞損傷.pdf

1、目的：
　　以人肺動脈內(nèi)皮細胞(Human pulmonary artery endothelial cell, HPAECs)為研究對象，探索成纖維細胞生長因子21(Fibroblast growth factor21, FGF21)對HPAECs低氧損傷、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（Endoplasmic reticulum stress, ERS）相關凋亡途徑的影響及其可能的調(diào)控機制。
　　方法：
　　人肺動脈內(nèi)皮細胞確定細胞純

2、度并傳代,隨機分為6組：常氧對照(Normoxia，N)組、低氧（Hypoxia，H）組、FGF21（F）組、Salubrinal（ERS-抑制劑，S）組、衣霉素（Tunicamycin-ERS激動劑，T）組、衣霉素+FGF21（T+F）組。FGF21、Salubrinal及衣霉素的給藥濃度分別為800ng/ml，20ng/ml，2.5ng/ml。常氧組細胞放置于常氧培養(yǎng)箱（參數(shù)設置：37℃，5％CO2，21%O2）中培養(yǎng)，低氧組、FG

3、F21組、Salubrinal組、衣霉素組及衣霉素+FGF21組細胞放置于低氧培養(yǎng)箱（參數(shù)設置：37℃，5%CO2，5%O2，90%N2）中培養(yǎng)，均培養(yǎng)24小時。采用CCK-8染色法檢測各組HPAECs增殖情況。TUNEL法檢測各組HPAECs凋亡情況。透射電鏡觀察各組 HPAECs超微結構的變化。Western-Blot法檢測各組HPAECs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激標記蛋白Bip及p-PERK蛋白、PERK蛋白、CHOP蛋白表達變化。Western

4、-Blot法檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激凋亡途徑相關蛋白 caspase-4、Bcl-2的表達變化。Transwell小室遷移法檢測各組HPAECs遷移能力。ELISA法檢測各組HPAECs細胞培養(yǎng)上清液中NO、ET-1含量。
　　結果：
　?、鸥鹘M肺動脈內(nèi)皮細胞增殖情況的差異：與常氧對照組相比，低氧組與ERS激動劑衣霉素組 HPAECs的增殖活性均降低（P值均＜0.01）；與低氧組相比， FGF21組與ERS抑制劑-Salubrinal

5、組HPAECs的增殖活性均顯著升高（P值均＜0.01）；與單純 ERS激動劑衣霉素組相比，同時給予 FGF21干預處理， HPAECs受損的增殖活性明顯恢復（P＜0.01）。⑵各組肺動脈內(nèi)皮細胞凋亡情況的差異：與常氧對照組相比，低氧組與ERS激動劑衣霉素組 HPAECs的凋亡細胞數(shù)均顯著升高（P值均＜0.01）；與低氧組相比，F(xiàn)GF21組與ERS抑制劑-Salubrinal組HPAECs的凋亡細胞數(shù)均顯著減少（P值均＜0.01）；與單純

6、ERS激動劑衣霉素組相比，同時給予FGF21干預處理，HPAECs的凋亡細胞數(shù)較前者減少（P＜0.01）。⑶各組肺動脈內(nèi)皮細胞電鏡超微結構的差異：電鏡下，常氧對照組可見細胞表面微絨毛，細胞內(nèi)線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；與常氧對照組相比，低氧組與ERS激動劑衣霉素組均表現(xiàn)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張明顯，核糖體脫落，空泡、自噬小體增多，并出現(xiàn)凋亡小體；與低氧組相比，F(xiàn)GF21組與ERS抑制劑-Salubrinal組均表現(xiàn)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張顯著減弱，空泡、自噬小體減少；與單

7、純ERS激動劑衣霉素組相比，同時給予FGF21干預處理，HPAECs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張較前者減弱，但仍較明顯，空泡、自噬小體減少。⑷各組肺動脈內(nèi)皮細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激標記性蛋白Bip的表達差異：與常氧對照組相比，低氧組與ERS激動劑衣霉素組的內(nèi)源性Bip蛋白的表達均顯著升高（P值均＜0.01）；與低氧組相比，F(xiàn)GF21組與ERS抑制劑-Salubrinal組的內(nèi)源性Bip蛋白表達均明顯降低（P值均＜0.01）；與單純ERS激動劑衣霉素組相比，同時給予

8、 FGF21干預處理，內(nèi)源性 Bip蛋白表達增加程度較前者明顯降低（P＜0.01）。⑸各組肺動脈內(nèi)皮細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激PERK-CHOP信號通路的檢測：與常氧對照組相比，低氧組與ERS激動劑衣霉素組的內(nèi)源性p-PERK、CHOP蛋白的表達均顯著升高（P值均＜0.01），低氧組與衣霉素組的內(nèi)源性 PERK蛋白表達均明顯減少（P值均＜0.01）；與低氧組相比，F(xiàn)GF21組與ERS抑制劑-Salubrinal組的內(nèi)源性p-PERK、CHOP蛋白表

9、達均明顯降低（P值均＜0.01），F(xiàn)GF21組與 ERS抑制劑-Salubrinal組的內(nèi)源性 PERK蛋白表達均明顯升高（P值均＜0.01）；與單純ERS激動劑衣霉素組相比，同時給予FGF21干預處理，內(nèi)源性p-PERK、CHOP蛋白表達增加程度較前者顯著降低（P值均＜0.01），內(nèi)源性PERK蛋白表達較前者明顯升高（P＜0.01）。⑹各組肺動脈內(nèi)皮細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關凋亡蛋白caspase-4及抗凋亡蛋白Bcl-2表達的差異：與常氧對照組

10、相比，低氧組與ERS激動劑衣霉素組的內(nèi)源性caspase-4蛋白的表達均顯著升高（P值均＜0.01），低氧組與ERS激動劑衣霉素組的內(nèi)源性Bcl-2蛋白表達均明顯減少（P值均＜0.01）；與低氧組相比，F(xiàn)GF21組與ERS抑制劑-Salubrinal組的內(nèi)源性 caspase-4蛋白表達均明顯降低（P值均＜0.01），F(xiàn)GF21組與ERS抑制劑-Salubrinal組的內(nèi)源性Bcl-2蛋白表達均明顯升高（P值均＜0.01）；與單純ERS

11、激動劑衣霉素組相比，同時給予FGF21干預處理，內(nèi)源性caspase-4蛋白表達受到顯著抑制，較前者明顯降低（P＜0.01）。⑺各組肺動脈內(nèi)皮細胞遷移能力的差異：與常氧對照組相比，低氧組與ERS激動劑衣霉素組發(fā)生遷移的HPAECs數(shù)量均顯著減少（P值均＜0.01）；與低氧組相比，F(xiàn)GF21組與ERS抑制劑-Salubrinal組發(fā)生遷移的HPAECs數(shù)量均明顯增加（P值均＜0.01）；與單純ERS激動劑衣霉素組相比，同時給予FGF21干

12、預處理， HPAECs受損的遷移能力明顯恢復（P＜0.01）。⑻各組肺動脈內(nèi)皮細胞內(nèi)皮功能檢測：與正常對照組相比，低氧組與ERS激動劑衣霉素組上清液中NO含量均明顯降低（P值均＜0.01），ET-1含量均顯著升高（P值均＜0.01）；與低氧組相比，F(xiàn)GF21組與ERS抑制劑-Salubrinal組上清液中NO含量均明顯升高（P值均＜0.05），ET-1含量均顯著降低（P值均＜0.01），并趨于常氧對照組；與單純 ERS激動劑衣霉素組相比

13、，同時給予FGF21干預處理，上清液中下調(diào)的NO含量明顯升高（P＜0.01），上調(diào)的ET-1含量顯著降低（P＜0.01）。
　　結論：
　　①內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激參與了低氧誘導的HPAECs的凋亡及功能紊亂。②FGF21可部分通過抑制 PERK-CHOP途徑及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關凋亡蛋白 caspase-4的表達，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激引起的肺動脈內(nèi)皮細胞的凋亡。③FGF21可能通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，緩解內(nèi)皮細胞的凋亡及改善內(nèi)皮功能紊亂，從而抑制低氧性肺