信號(hào)銜接蛋白p66shc的沉默延緩營養(yǎng)脅迫誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞自噬.pdf

1、在營養(yǎng)匱乏的條件下，細(xì)胞通過依賴溶酶體的自噬過程消化細(xì)胞內(nèi)的大分子、錯(cuò)誤折疊的蛋白分子、衰老的細(xì)胞器等來滿足細(xì)胞對營養(yǎng)物質(zhì)的基礎(chǔ)需求，得以存活。在脅迫狀態(tài)下，腫瘤細(xì)胞的自噬可以為腫瘤細(xì)胞提供營養(yǎng)物質(zhì)，也可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞脫離基質(zhì)得以存活。然而，過度的或者是過低的自噬水平會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。前期的研究表明，信號(hào)銜接蛋白p66Shc在細(xì)胞的代謝過程中發(fā)揮著重要作用;動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)p66Shc的穩(wěn)定超表達(dá)可以促進(jìn)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的失巢凋亡（細(xì)胞失

2、去貼附引起的凋亡），進(jìn)而抑制轉(zhuǎn)移。而p66Shc在肺癌細(xì)胞自噬中的功能還有待進(jìn)一步研究。
　　 目的:
　　 研究營養(yǎng)脅迫的肺癌A549細(xì)胞中，細(xì)胞自噬相關(guān)標(biāo)志分子如LC3B，Beclin1，p62等的變化。在此基礎(chǔ)上，探討p66shc在細(xì)胞自噬中的功能;通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究，初步闡釋p66Shc對細(xì)胞自噬的調(diào)控機(jī)制，為更加深入地了解p66shc的功能提供新的研究方向。本研究將為以p66Shc為靶點(diǎn)治療肺癌提供理論依據(jù)，同

3、時(shí)豐富對細(xì)胞自噬在肺癌細(xì)胞生物學(xué)中功能的認(rèn)知。
　　 方法:
　　 首先利用慢病毒感染的實(shí)驗(yàn)方法產(chǎn)生失去功能和獲得功能的穩(wěn)定細(xì)胞系，即在A549細(xì)胞和BEAS-2B細(xì)胞中沉默p66Shc，在MCF-7細(xì)胞過表達(dá)p66shc。在營養(yǎng)脅迫條件下，通過Immunoblot的方法檢測自噬標(biāo)志分子LC3B，p62的變化，進(jìn)一步研究信號(hào)通路分子如Erk1/2，Akt等的磷酸化水平以及凋亡相關(guān)的分子如cleaved caspases的

4、變化。通過電轉(zhuǎn)化表達(dá)RFP-LC3B，并在共聚焦顯微鏡下觀察和計(jì)數(shù)LC3B的熒光斑點(diǎn)。使用細(xì)胞增殖以及細(xì)胞死亡試劑盒檢測細(xì)胞在p66shc表達(dá)和沉默情況下的細(xì)胞增殖和死亡情況。GST-pulldown用于檢測k-Ras在p66Shc表達(dá)和沉默情況下的活性。
　　 結(jié)果:
　　 (1)在A549細(xì)胞中，營養(yǎng)脅迫誘導(dǎo)p66Shc的蛋白和RNA表達(dá)水平均升高，p66Shc沉默降低營養(yǎng)脅迫誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。(2) p66Shc延緩

5、營養(yǎng)脅迫誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬:與對照細(xì)胞相比，p66shc沉默的A549細(xì)胞中共聚焦顯微鏡觀察到的RFP-LC3B斑點(diǎn)數(shù)目在正常培養(yǎng)基或營養(yǎng)脅迫1天后均顯著降低。正常培養(yǎng)的A549細(xì)胞在p66shc沉默后，LC3B-Ⅱ與LC3B-Ⅰ的蛋白水平的比值(LC3B-Ⅱ/Ⅰ)比對照降低了約3倍。在營養(yǎng)脅迫1天后p66shc沉默的A549細(xì)胞的LC3B-Ⅱ/Ⅰ比對照降低了30％，營養(yǎng)脅迫3天后p66shc沉默的A549細(xì)胞LC3B-Ⅱ/Ⅰ的比例與對照相

6、比無顯著差別。在不表達(dá)p66shc的MCF-7細(xì)胞中過表達(dá)p66shc提高了LC3B-Ⅱ/Ⅰ比例，自噬相關(guān)分子Atg5的沉默降低了LC3B-Ⅱ比例的水平但是并沒有改變p66shc提高LC3B-Ⅱ/Ⅰ比例的趨勢。在營養(yǎng)脅迫8h時(shí)，BEAS-2B細(xì)胞沉默p66shc導(dǎo)致LC3-Ⅱ/Ⅰ的比例顯著降低。(3)臨床樣本中p66shc與LC3B-Ⅱ的表達(dá)具有正相關(guān)性:在24例臨床肺癌及其癌旁組織中，通過蛋白水平分析發(fā)現(xiàn)有15例組織的p66shc表達(dá)

7、水平與LC3B-Ⅱ呈正相關(guān)。(4) p66shc沉默導(dǎo)致細(xì)胞增殖水平的降低，表明p66Shc沉默降低營養(yǎng)脅迫誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡率不依賴于增殖水平的提高。營養(yǎng)脅迫可以導(dǎo)致p66shc沉默的以及對照A549細(xì)胞中的磷酸化Erk1/2水平的降低，但是隨著脅迫時(shí)問的延長，p66shc沉默的細(xì)胞中磷酸化Erk1/2的水平升高，磷酸化Akt的水平降低。自噬早期抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)可以顯著的提高磷酸化的Erk1/2的水平;而且，p66shc沉

8、默導(dǎo)致k-Ras-GTP水平升高，Beclin1水平降低，但p62水平無顯著變化。這些結(jié)果表明k-Ras-Erk1/2-Beclin1通路可能在p66shc影響自噬的過程中發(fā)揮重要的作用。(5)p66shc沉默導(dǎo)致cleaved caspase-7，PARP水平的降低，但是并不影響cleavedcaspase-6，-9的水平;表明沉默p66shc可降低caspase-7，PARP的活性，進(jìn)而提高凋亡抗性。
　　 結(jié)論:
　

9、　 在營養(yǎng)脅迫狀態(tài)下，信號(hào)銜接蛋白p66shc促進(jìn)細(xì)胞自噬水平升高;而沉默p66shc的肺癌細(xì)胞在營養(yǎng)脅迫狀態(tài)下死亡率降低;這表明p66shc的沉默可以延緩細(xì)胞自噬水平并且增加凋亡抗性，這一延緩肺癌細(xì)胞自噬性死亡的過程可能由k-Ras-Erk1/2-Beclin1通路所介導(dǎo)?；诜伟┡R床樣本的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)也進(jìn)一步證實(shí)了這一推測。本研究針對p66shc在肺癌細(xì)胞自噬中的功能和調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了探討，研究結(jié)果將有助于豐富和完善細(xì)胞自噬這一復(fù)雜動(dòng)態(tài)