miR-486-5p靶向SIRT1抑制肝癌干細(xì)胞功能的相關(guān)研究.pdf

1、腫瘤組織中的腫瘤細(xì)胞并不是均一的群體，其中存在一小部分細(xì)胞，這一小部分的細(xì)胞具有自我更新并產(chǎn)生異質(zhì)性腫瘤的能力，表現(xiàn)出干細(xì)胞樣特性，被稱(chēng)為腫瘤干細(xì)胞(CSC)。腫瘤干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)為闡明腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和耐藥提供了理論依據(jù)。許多研究提示腫瘤干細(xì)胞可能是腫瘤發(fā)生、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和耐藥的根源，探索腫瘤干細(xì)胞的作用和調(diào)控機(jī)制，有望為開(kāi)發(fā)靶向腫瘤干細(xì)胞的新的治療手段奠定基礎(chǔ)。
　　微小RNA(miRNA)是一類(lèi)非編碼的小分子RNA，長(zhǎng)度約為19-

2、22個(gè)核苷酸的小分子。miRNA由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的大小約為70-90nt的單鏈前體經(jīng)過(guò)Dicer酶進(jìn)行剪切加工生成，其通過(guò)與靶基因的3'非編碼區(qū)(3'UTR)堿性互補(bǔ)配對(duì)相結(jié)合，可以特異性抑制或降解靶基因的mRNA，進(jìn)而抑制靶基因的翻譯，調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。越來(lái)越多的證據(jù)表明，micoRNA在許多腫瘤中表達(dá)異常，能夠參與腫瘤的形成、生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和耐藥等，其中一些miRNAs與肝癌干細(xì)胞特性維持有著密切的聯(lián)系。因此，尋找在肝癌干細(xì)胞和肝癌

3、非干細(xì)胞中差異表達(dá)顯著的miRNA，無(wú)疑具有重要意義。
　　本課題研究思路為:首先，篩選肝癌干細(xì)胞中表達(dá)顯著下調(diào)的miRNA，在此基礎(chǔ)上獲得可能在肝癌干細(xì)胞維持中發(fā)揮重要作用的候選miRNA，進(jìn)一步研究驗(yàn)證候選miRNA對(duì)腫瘤干細(xì)胞的生物學(xué)作用的影響并明確其發(fā)揮作用的靶基因。
　　第一部分通過(guò)The Cancer Genome Atlas(TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)，比較肝癌組織與癌旁組織中miRNAs的表達(dá)情況，篩選在肝癌組織中表達(dá)

4、下調(diào)的miRNAs。結(jié)果顯示，59個(gè)miRNAs在肝癌組織中表達(dá)下調(diào)顯著。進(jìn)一步，我們通過(guò)成球?qū)嶒?yàn)(tumor sphere)體外富集肝癌干細(xì)胞，并利用熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行篩選驗(yàn)證候選miRNAs在貼壁細(xì)胞和成球干細(xì)胞(Huh7和PLC)中的表達(dá)情況，意圖尋找在肝癌干細(xì)胞中顯著下調(diào)的miRNA。結(jié)果顯示miR-99a、miR-10a、miR-486、miR-195、miR-154和miR-138表達(dá)下調(diào)明顯。利用流式細(xì)胞術(shù)分選CD13

5、陽(yáng)性和陰性細(xì)胞、EpCAM陽(yáng)性和陰性細(xì)胞，進(jìn)一步篩選在CD13和EpCAM雙陽(yáng)性細(xì)胞中均表達(dá)下調(diào)顯著的miRNA，結(jié)果顯示miR-486-5p在CD13+EpCAM+細(xì)胞中下調(diào)顯著。該部分研究結(jié)果表明:miR-486-5p在肝癌組織和肝癌干細(xì)胞中下調(diào)顯著。有研究表明miR-486-5p作為抑癌基因，在某些腫瘤中發(fā)揮作用，例如肺癌、胃癌等[7,8]。但是miR-486-5p在肝癌發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)作用，尤其是其對(duì)肝癌干細(xì)胞的作用未見(jiàn)報(bào)道，

6、因此，在第二部分工作中，開(kāi)展miR-486-5p對(duì)肝癌細(xì)胞以及肝癌干細(xì)胞生物學(xué)作用的研究。
　　第二部分利用慢病毒包裝系統(tǒng)，獲得miR-486-5p過(guò)表達(dá)的毒液上清，攻擊肝癌細(xì)胞，建立穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR-486-5p的肝癌細(xì)胞系;利用成球?qū)嶒?yàn)(tumor sphere)、侵襲實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、CCK8細(xì)胞耐藥實(shí)驗(yàn)及裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)，探究miR-486-5p對(duì)肝癌干細(xì)胞的成球、侵襲、遷移、耐藥和成瘤能力的影響;利用熒光定量PCR技術(shù)和流

7、式細(xì)胞術(shù)，探究miR-486-5p對(duì)肝癌干細(xì)胞干性基因及干性表面標(biāo)志物的影響。結(jié)果顯示，miR-486-5p可以體外抑制肝癌干細(xì)胞的增殖、侵襲遷移、耐藥、干性基因和標(biāo)志物的表達(dá)，體內(nèi)抑制肝癌細(xì)胞的成瘤能力。
　　第三部分為了進(jìn)一步探討miR-486-5p對(duì)肝癌干細(xì)胞的作用機(jī)制，利用生物信息學(xué)在線網(wǎng)站TargetScan、Pictar和microRNA.org預(yù)測(cè)miR-486-5p的靶基因，從腫瘤、增殖、轉(zhuǎn)移和干性四方面篩選miR

8、-486-5p的候選靶基因;熒光定量PCR技術(shù)驗(yàn)證在miR-486-5p過(guò)表達(dá)或干涉的肝癌細(xì)胞和成球干細(xì)胞中其候選靶基因的表達(dá)情況;利用免疫組化和qRT-PCR技術(shù)，進(jìn)一步驗(yàn)證在肝癌組織中miR-486-5p與靶基因的關(guān)系;最后利用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)，明確miR-486-5p的靶基因。結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平，SIRT1與miR-486-5p的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系;根據(jù)miR-486-5p與SIRT13'UTR的結(jié)合情況，證明SIRT

9、1是miR-486-5p的靶基因之一。
　　第四部分利用RNA干擾技術(shù)(RNAi)，構(gòu)建SIRT1的慢病毒干涉載體;利用慢病毒包裝系統(tǒng)，構(gòu)建穩(wěn)定低表達(dá)SIRT1的肝癌細(xì)胞系;通過(guò)成球?qū)嶒?yàn)、平板克隆實(shí)驗(yàn)、CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、耐藥實(shí)驗(yàn)及裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)，探究SIRT1對(duì)肝癌干細(xì)胞的增殖和耐藥的影響。結(jié)果顯示，成功構(gòu)建SIRT1慢病毒干涉載體，獲得穩(wěn)定低表達(dá)SIRT1的肝癌細(xì)胞系，并證明SIRT1促進(jìn)肝癌細(xì)胞和肝癌干細(xì)胞的增殖、耐藥和

10、成瘤能力。
　　綜上，我們的工作首先證實(shí)了miR-486-5p可抑制肝癌干細(xì)胞的增殖、干性特征、侵襲、遷移、耐藥和體內(nèi)成瘤能力。其次，揭示了miR-486-5p對(duì)肝癌干細(xì)胞的作用是通過(guò)調(diào)控SIRT1的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
　　該研究的意義在于:人工合成的miRNA與小分子化合物的功能相似，可以用于疾病的治療。同時(shí)miRNA可以被作為診斷腫瘤的生物標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)。miR-486-5p有望作為一個(gè)新的靶向肝癌干細(xì)胞的miRNA，為肝