牛輪狀病毒RT-PCR檢測(cè)和基于VP6重組抗原檢測(cè)血清抗體ELISA方法初步建立.pdf_第1頁(yè)
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1、牛輪狀病毒(Brovine Rotavirus,BRV)是呼腸孤病毒科輪狀病毒屬的成員。是引起犢牛腹瀉的主要病原之一。
   本實(shí)驗(yàn)利用牛輪狀病毒VP6基因513~916間高保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物,從感染牛輪狀病毒細(xì)胞培養(yǎng)物和糞便樣品提取核酸,擴(kuò)增到大小400bp左右的片段,經(jīng)測(cè)序證明為輪狀病毒VP6片段,對(duì)擴(kuò)增的敏感性測(cè)定表明,細(xì)胞培養(yǎng)物病毒含量在10-3 TCID50時(shí),PCR擴(kuò)增仍為陽(yáng)性反應(yīng),該反應(yīng)亦能擴(kuò)增豬輪狀病毒的VP6基因

2、片段,而對(duì)豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)均不出現(xiàn)反應(yīng)。說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)建立的PCR方法對(duì)A群輪狀病毒的擴(kuò)增具有高度特異性。對(duì)擴(kuò)增的退火溫度測(cè)定表明,溫度范圍在40℃~60℃對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物均沒(méi)有影響。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果均說(shuō)明這對(duì)引物作為診斷引物具有一定的應(yīng)用價(jià)值。
   以牛輪狀病毒NCDV標(biāo)準(zhǔn)株擴(kuò)增獲得了VP6全基因序列,將其定向插入表達(dá)載體,通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE和Western blot分析,證明了約5

3、2kDa的目的蛋白表達(dá)。通過(guò)包涵體提取,Ni親和層析,獲得了純化的重組牛輪狀病毒VP6蛋白。對(duì)純化蛋白進(jìn)一步進(jìn)行Western blot分析表明,該蛋白可與全病毒抗血清發(fā)生特異性反應(yīng),為以該蛋白作為檢測(cè)抗原代替牛輪狀病毒全病毒抗原,避免培養(yǎng)病毒、純化病毒等繁瑣工藝,為抗原制備提供了廉價(jià)的方法。
   以牛輪狀病毒VP6蛋白作為檢測(cè)抗原,初步建立了間接ELISA進(jìn)行血清抗體的檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)對(duì)影響ELISA檢測(cè)的抗原包被量、包被條

4、件和封閉液種類進(jìn)行了探索。
   采用矩陣法,通過(guò)對(duì)抗原包被濃度、包被稀釋液和不同包被條件效果的比對(duì),最終確定了用PH8.6磷酸鹽將純化的VP6重組蛋白稀釋為0.25μg/mL加入到反應(yīng)孔中,包被工作在37℃ 2.0h或4℃包被過(guò)夜。
   為降低ELISA反應(yīng)的非特異性,本試驗(yàn)對(duì)多種封閉試劑或封閉劑聯(lián)合使用進(jìn)行了封閉效果對(duì)比試驗(yàn),從封閉效果看,4% PEG20000作為封閉液,37℃封閉2h時(shí)效果最佳。
  

5、通過(guò)條件探索,初步建立的間接ELISA方法檢測(cè)牛輪狀病毒血清抗體的最佳工作條件: pH8.6磷酸鹽緩沖液稀包被VP6蛋白,濃度為0.25μg/mL,200μl/孔,在37℃包被2.0h或在4℃包被過(guò)夜;250μl/孔,PBST洗滌3次,每次3分鐘;每孔加入200μl 4% PEG20000作為封閉液,37℃封閉2.0h,同樣方法洗滌3次;加入1:100封閉液稀釋的被檢血清,100μl/孔,37℃作用1h,洗滌3次;加入封閉液稀釋二抗,1

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