牛輪狀病毒RT-PCR檢測和基于VP6重組抗原檢測血清抗體ELISA方法初步建立.pdf

1、牛輪狀病毒（Brovine Rotavirus，BRV）是呼腸孤病毒科輪狀病毒屬的成員。是引起犢牛腹瀉的主要病原之一。
　　 本實(shí)驗(yàn)利用牛輪狀病毒VP6基因513~916間高保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，從感染牛輪狀病毒細(xì)胞培養(yǎng)物和糞便樣品提取核酸，擴(kuò)增到大小400bp左右的片段，經(jīng)測序證明為輪狀病毒VP6片段，對擴(kuò)增的敏感性測定表明，細(xì)胞培養(yǎng)物病毒含量在10-3 TCID50時(shí)，PCR擴(kuò)增仍為陽性反應(yīng)，該反應(yīng)亦能擴(kuò)增豬輪狀病毒的VP6基因

2、片段，而對豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）均不出現(xiàn)反應(yīng)。說明本實(shí)驗(yàn)建立的PCR方法對A群輪狀病毒的擴(kuò)增具有高度特異性。對擴(kuò)增的退火溫度測定表明，溫度范圍在40℃~60℃對擴(kuò)增產(chǎn)物均沒有影響。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果均說明這對引物作為診斷引物具有一定的應(yīng)用價(jià)值。
　　 以牛輪狀病毒NCDV標(biāo)準(zhǔn)株擴(kuò)增獲得了VP6全基因序列，將其定向插入表達(dá)載體，通過誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE和Western blot分析，證明了約5

3、2kDa的目的蛋白表達(dá)。通過包涵體提取，Ni親和層析，獲得了純化的重組牛輪狀病毒VP6蛋白。對純化蛋白進(jìn)一步進(jìn)行Western blot分析表明，該蛋白可與全病毒抗血清發(fā)生特異性反應(yīng)，為以該蛋白作為檢測抗原代替牛輪狀病毒全病毒抗原，避免培養(yǎng)病毒、純化病毒等繁瑣工藝，為抗原制備提供了廉價(jià)的方法。
　　 以牛輪狀病毒VP6蛋白作為檢測抗原，初步建立了間接ELISA進(jìn)行血清抗體的檢測。本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)對影響ELISA檢測的抗原包被量、包被條

4、件和封閉液種類進(jìn)行了探索。
　　 采用矩陣法，通過對抗原包被濃度、包被稀釋液和不同包被條件效果的比對，最終確定了用PH8.6磷酸鹽將純化的VP6重組蛋白稀釋為0.25μg/mL加入到反應(yīng)孔中，包被工作在37℃ 2.0h或4℃包被過夜。
　　 為降低ELISA反應(yīng)的非特異性，本試驗(yàn)對多種封閉試劑或封閉劑聯(lián)合使用進(jìn)行了封閉效果對比試驗(yàn)，從封閉效果看，4％ PEG20000作為封閉液，37℃封閉2h時(shí)效果最佳。
　　

5、通過條件探索，初步建立的間接ELISA方法檢測牛輪狀病毒血清抗體的最佳工作條件： pH8.6磷酸鹽緩沖液稀包被VP6蛋白，濃度為0.25μg/mL，200μl/孔，在37℃包被2.0h或在4℃包被過夜；250μl/孔，PBST洗滌3次，每次3分鐘；每孔加入200μl 4％ PEG20000作為封閉液，37℃封閉2.0h，同樣方法洗滌3次；加入1：100封閉液稀釋的被檢血清，100μl/孔，37℃作用1h，洗滌3次；加入封閉液稀釋二抗，1