斑蝥素和去甲斑蝥素抗膀胱腫瘤作用的實驗研究.pdf

1、斑蝥是鞘翅目(Coleoptera)芫青科(Meloidae)斑芫青屬(Mylabris)昆蟲的俗稱，是有效抗腫瘤天然藥物。斑蝥素(Cantharidin，CA)是斑蝥抗腫瘤的有效成份，其是一種半帖烯毒素，可從蟲體提取或人工合成。因其口服及靜脈注射具有強烈的泌尿系統(tǒng)和消化系統(tǒng)刺激作用，不易為患者所接受而限制了它的使用。去甲斑蝥素(Norcantharidin，NCTD)是CA的衍生物，與CA有類似的抗腫瘤作用，且其毒性明顯低于CA。盡管

2、祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)在臨床實踐中早已將斑蝥提取物用于某些腫瘤的治療中，但將其提取物及其衍生物作為腔內(nèi)灌注預(yù)防與治療淺表膀胱腫瘤國內(nèi)外均未見報告。 目的：研究CA和NCTD對膀胱腫瘤細胞體外的生長抑制作用及其作用機理，進一步研究CA和NCTD膀胱灌注治療小鼠膀胱腫瘤的作用及其機制，為斑蝥提取物及其衍生物膀胱灌注治療人膀胱腫瘤提供實驗依據(jù)。 內(nèi)容CA和NCTD抗膀胱腫瘤細胞系的體外實驗研究，CA和NCTD膀胱灌注對小鼠膀胱和血液影響

3、的安全性研究，CA和NCTD膀胱灌注治療小鼠膀胱腫瘤的實驗研究。 方法：使用不同濃度的CA和NCTD對人膀胱腫瘤EJ、T24、SqCa細胞和小鼠膀胱腫瘤細胞MB49進行體外培養(yǎng)，取藥物作用不同時間的細胞進行MTT實驗和FCMAnnexinV-PI雙染色法檢測細胞凋亡率，進而選擇出一種抑制膀胱腫瘤細胞增殖的有效藥物，并篩選出最佳藥物濃度和作用時間。用最佳濃度的藥物與細胞共同培養(yǎng)，光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡、丫啶橙熒光染色、Hoechs

4、t33258熒光染色法觀察細胞的形態(tài)學(xué)變化，激光共聚焦顯微鏡觀察(FITC-AnnexinV/PI雙染色法)MB49細胞凋亡，凝膠電泳觀察凋亡細胞的DNA片斷化；分光光度法檢測細胞Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9活性變化；Westernblot法檢測細胞Bcl-2和Bax表達的變化；PCR-TRAP-銀染法檢測端粒酶活性變化，激光共聚焦顯微鏡測定MB49細胞胞漿內(nèi)Ca2+濃度變化。5倍最佳抑制細胞增殖濃度的CA

5、和NCTD進行小鼠膀胱灌注，常規(guī)病理和電鏡檢測小鼠膀胱和FCM檢查血液淋巴細胞亞群變化。復(fù)制小鼠膀胱原位腫瘤種植模型后將篩選出最佳濃度的藥物對小鼠膀胱進行灌注，觀察記錄實驗組和對照組小鼠生存時間、腫瘤生長情況、小鼠生存情況(包括體重、活動、飲食、血尿的出現(xiàn)等)，免疫組化驗證CA和NCTD對小鼠膀胱腫瘤的抑制作用。 結(jié)果：CA和NCTD在體外對人膀胱腫瘤EJ、T24細胞和小鼠膀胱腫瘤MB49細胞增殖有明顯抑制作用，在一定的濃度和時

6、間范圍內(nèi)呈明顯的時間一效應(yīng)關(guān)系和濃度-效應(yīng)關(guān)系，抑制EJ和T24細胞的最佳藥物濃度CA為20gmol/L、NCTD為60μmol/L；抑制MB49細胞的最佳藥物濃度CA為40μmol/L、NCTD為60μmol/L；NCTD對于SqCa細胞增殖的抑制作用不明顯，而CA對于SqCa細胞增殖的抑制作用明顯，最佳藥物濃度為60μmol/L；用最佳藥物濃度的CA和NCTD與膀胱腫瘤細胞共同培養(yǎng)，隨著作用時間延長Caspase分光光度法檢測發(fā)現(xiàn)C

7、asoase-3、Caspase-8、Caspase-9的活性增加；Westernblot顯示，T24和MB49細胞Bcl-2的表達均逐漸減弱，Bax的表達均逐漸增強。PCR-TRAP-銀染法檢測顯示，MB49細胞的端粒酶活性隨著CA作用時間的延長而逐漸減弱；激光共聚焦顯微鏡測定MB49細胞胞漿內(nèi)Ca2+濃度明顯增加。C57BL/6小鼠原位膀胱腫瘤模型的成瘤率為96.7％。CA組治愈率為80％，NCTD為60％，均明顯高于對照組的13.

8、3％。TUNEL檢測顯示，用藥組殘存腫瘤細胞出現(xiàn)凋亡，越近腫瘤表面，凋亡越明顯。灌注后，血液淋巴細胞亞群各組無差別，用藥組的膀胱移行上皮明顯變薄外，無其它異常改變。各組的肝、脾、肺、心、腎未見明顯損害。 結(jié)論：CA和NCTD體外對膀胱腫瘤細胞有良好的抑制作用，其作用機理可能與其激活Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的活性，增強bcl-2和減弱Bax的表達，增加胞漿中Ca2+濃度而誘導(dǎo)凋亡有關(guān)。硝酸銀灼傷、