去甲斑蝥素對(duì)膽管癌RBE細(xì)胞作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、目的:研究去甲斑蝥素對(duì)膽管癌RBE-TCHU179細(xì)胞的凋亡、凋亡相關(guān)蛋白、細(xì)胞周期、細(xì)胞骨架、超微結(jié)構(gòu)的影響，探討去甲斑蝥素對(duì)膽管癌RBE細(xì)胞的作用及其機(jī)制。
　　方法:
　　1 MTT實(shí)驗(yàn):將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞種于96孔板中，待貼壁后加入200μl含0、5、10、20、40μg/ml濃度去甲斑蝥素的RPMI1640培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)24、48、72小時(shí)。后每孔加入MTT工作溶液，溫箱中作用4小時(shí)，用150μl DMSO溶解結(jié)晶

2、，在酶標(biāo)儀上讀取吸光度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
　　2流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率檢測(cè):收集24小時(shí)同上濃度實(shí)驗(yàn)組及陰性對(duì)照組細(xì)胞， PBS洗滌3遍后重懸于Binding Buffer中，先后加入AnnexinV-FITC及PI，于流式細(xì)胞儀上檢測(cè)。
　　3流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期分布:對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的RBE細(xì)胞應(yīng)用同上濃度的去甲斑蝥素干預(yù)24小時(shí)，收集并固定于預(yù)冷的70％乙醇中，4℃過(guò)夜，離心去除乙醇，PBS洗滌后加入PI染色，于流式細(xì)胞儀上

3、機(jī)測(cè)試。
　　4瑞氏-姬姆薩染色觀察細(xì)胞形態(tài):RBE細(xì)胞種于六孔板中，加入不同濃度去甲斑蝥素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)。瑞氏-姬姆薩染料固定后加入蒸餾水染色，立即在油鏡下觀察。
　　5 AO/EB染色法觀察細(xì)胞凋亡及形態(tài):細(xì)胞以上述同樣的方式處理后，蓋在AO/EB染液中染色，熒光顯微鏡下觀察。
　　6 Western blot檢測(cè)bax、Actived-caspase-3和細(xì)胞色素c表達(dá):細(xì)胞經(jīng)過(guò)去甲斑蝥素作用24小時(shí)，收

4、集后提取總蛋白或胞漿蛋白，經(jīng)過(guò)分離、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗、漂洗、熒光二抗、漂洗后上機(jī)掃描。
　　7免疫組化染色觀察α-Tubulin分布變化:RBE細(xì)胞同上分組去甲斑蝥素處理，固定，滴加一抗、孵育、滴加二抗、增強(qiáng)顯色、DAB顯色，梯度酒精脫水干燥，中性樹(shù)膠封固。
　　8 Real-time PCR檢測(cè)mRNA轉(zhuǎn)錄水平:收集去甲斑蝥素作用24小時(shí)后細(xì)胞，提取總RNA，合成cDNA。bax、 bcl-2、 Caspase-3及內(nèi)參β

5、-actin按各自反應(yīng)體系配比，于熒光PCR儀檢測(cè)。
　　9掃描電鏡觀察去甲斑蝥素誘導(dǎo)RBE細(xì)胞膜表面超微結(jié)構(gòu)變化: RBE細(xì)胞經(jīng)去甲斑蝥素作用12小時(shí)、戊二醛固定、脫水、真空干燥、鍍金后于掃描電子顯微鏡觀察。
　　10透射電鏡觀察去甲斑蝥素誘導(dǎo)RBE細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化:RBE細(xì)胞經(jīng)去甲斑蝥素干預(yù)12小時(shí)，收集細(xì)胞團(tuán)塊經(jīng)戊二醛固定、鋨酸固定、丙酮梯度脫水，環(huán)氧丙烷置換，環(huán)氧樹(shù)脂包埋、聚合、超薄切片、醋酸雙氧鈾-枸櫞酸鉛染色，透

6、射電鏡觀察。
　　結(jié)果:
　　1 MTT實(shí)驗(yàn)顯示去甲斑蝥素對(duì)膽管癌細(xì)胞生長(zhǎng)呈抑制作用，不同濃度去甲斑蝥素不同時(shí)間作用于膽管癌RBE細(xì)胞，其抑制率呈時(shí)間—?jiǎng)┝恳蕾囮P(guān)系(P＜0.05)，非線性擬合計(jì)算出24小時(shí)的IC50值為36.9μg/ml。
　　2 Annexin V-FITC/PI雙染法顯示去甲斑蝥素作用24小時(shí)后，RBE細(xì)胞均出現(xiàn)了明顯的早期凋亡，并在劑量升高后，晚期凋亡所占比例相應(yīng)的升高?？偟蛲雎食蕜┝恳蕾囆?，大

7、于10μg/ml實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　3去甲斑蝥素作用24小時(shí)使RBE細(xì)胞阻滯在G2/M期，與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000，P=0.000，P=0.000,P＜0.01)。
　　4瑞氏-姬姆薩染色與AO/EB染色細(xì)胞可見(jiàn)不同濃度去甲斑蝥素處理后細(xì)胞呈由輕到重不同程度的損傷和典型凋亡變化。
　　5 AO/EB染色熒光顯微鏡低倍鏡下觀測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示:去甲斑蝥素作用于R

8、BE細(xì)胞24小時(shí)后，隨劑量升高橙色熒光細(xì)胞中呈簇出現(xiàn)并在視野中所占比例升高。40μg/ml劑量時(shí)，視野中橙色細(xì)胞占83.1％±15.6，明顯高于陰性對(duì)照組(P＜0.01)。
　　6 Real-time PCR及Western blot結(jié)果顯示，細(xì)胞色素c在胞漿中的濃度增加，bax、Actived-caspase-3在細(xì)胞中的含量漸增加，bcl-2 mRNA表達(dá)降低。
　　7α-Tubulin免疫組化染色觀察到去甲斑蝥素干預(yù)后

9、，微管蛋白α-Tubulin骨架結(jié)構(gòu)被破壞，呈現(xiàn)無(wú)結(jié)構(gòu)均一的環(huán)狀。分裂中期的細(xì)胞無(wú)紡錘體出現(xiàn)。
　　8 Real-time PCR檢測(cè)α-Tubulin mRNA表達(dá)水平均明顯降低(P=0.002，P=0.000，P＜0.01)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　9掃描電鏡觀察去甲斑蝥素誘導(dǎo)膽管癌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。20μg/ml去甲斑蝥素使細(xì)胞突起變細(xì)斷裂，表面微絨毛消失，表面卷曲、畸形。40μg/ml劑量時(shí)，細(xì)胞體積明顯縮小，表面

10、微絨毛和突起完全消失，膜結(jié)構(gòu)出現(xiàn)凹陷，部分細(xì)胞形成有完整包膜小泡樣結(jié)構(gòu)突起于細(xì)胞表面。
　　10透射電鏡觀察到20μg/ml去甲斑蝥素使細(xì)胞表面微絨毛消失，胞質(zhì)減少，核膜向外呈銳角突起，亦可見(jiàn)部分包膜向外球形膨出，胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡。40μg/ml劑量時(shí)，細(xì)胞皺縮，表面微絨毛消失，細(xì)胞核中染色質(zhì)濃縮，體積縮小，電子密度增加，邊集于核邊呈新月形，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，脫顆粒，胞質(zhì)出現(xiàn)空泡，線粒體嵴消失，包膜向外球形膨出，部分胞質(zhì)填充其中。

11、　　結(jié)論:
　　1去甲斑蝥素可抑制人膽管癌RBE-TCHU179細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，呈時(shí)間—?jiǎng)┝恳蕾囮P(guān)系。去甲斑蝥素作用后光鏡和電鏡均呈典型凋亡改變。
　　2去甲斑蝥素通過(guò)增加bax、抑制bcl-2的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，釋放細(xì)胞色素c激活Caspase-3誘導(dǎo)RBE細(xì)胞凋亡。
　　3去甲斑蝥素通過(guò)破壞膽管癌RBE細(xì)胞tubulin骨架、抑制α-TubulinmRNA的表達(dá)，阻止紡錘體的形成，將細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，導(dǎo)致