偽狂犬病毒PK基因缺失轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建和表達(dá).pdf

1、本試驗(yàn)以偽狂犬病毒TK/gI缺失疫苗株為親本株提取病毒基因組DNA，用限制性內(nèi)切酶AscⅠ酶切基因組獲得含完整PK基因的8.7kb片段，將此片段克隆入pPolyⅡ載體的AscⅠ多克隆位點(diǎn)獲得中間載體P8-AA。用限制性內(nèi)切酶SphⅠ+NdeⅠ缺失質(zhì)粒P8-AA中PK基因的2218bp片段，在此缺失區(qū)插入質(zhì)粒pEGFP-G中含綠色熒光蛋白基因和狂犬病病毒糖蛋白基因(G)的完整表達(dá)盒。構(gòu)建出可以用于同源重組的轉(zhuǎn)移載體P8-EGFP-G(正)

2、和P8-EGFP-G-r(反)；P8-AA質(zhì)粒缺失PK基因之后在其缺失部位克隆入EGFP基因的完整表達(dá)盒構(gòu)建出通用轉(zhuǎn)移載體P8-EGFP(正)和P8-EGFP-r(反)質(zhì)粒。 將六種質(zhì)粒pEGFP-c1，pEGFP-G，P8-EGFP(正)，P8-EGFP-r(反)，Pg-EGFP-G(正)，P8-EGFP-G-r(反)，分別在長(zhǎng)有70﹪PK細(xì)胞的六孔細(xì)胞培養(yǎng)板上做瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果質(zhì)粒pEGFP-c1，

3、pEGFP-G，P8-EGFP-r(反)，P8-EGFP-G-r(反)均出現(xiàn)強(qiáng)弱程度不同的熒光，上述結(jié)果說明質(zhì)粒P8-EGFP-r(反)，P8-EGFP-G-r(反)可以實(shí)現(xiàn)綠色熒光蛋白基因的瞬時(shí)表達(dá)，因此作為通用轉(zhuǎn)移載體是可行的，可以用于同源重組。同時(shí)也說明質(zhì)粒P8-EGFP和P8-EGFP-G的兩側(cè)同源重組臂中存在負(fù)調(diào)控序列，抑制了正向質(zhì)粒的EGFP基因表達(dá)，至于負(fù)調(diào)控序列的位置和作用機(jī)理還有待于進(jìn)一步研究。將PRVTK/gI缺失疫