含GFP報告基因的偽狂犬病病毒Ea株gG基因缺失重組病毒的構(gòu)建.pdf

1、偽狂犬病病毒(Pseudorbies virus,PRV)屬皰疹病毒科、甲型皰疹病毒亞科中的豬皰疹病毒Ⅰ型，它能導(dǎo)致多種家畜和野生動物發(fā)生急性傳染病。豬是該病毒的貯存者和傳染源，豬感染PRV后常表現(xiàn)為神經(jīng)系統(tǒng)的功能紊亂和呼吸系統(tǒng)疾病并引起嚴(yán)重的繁殖障礙。該病已給我國乃至全球的養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，預(yù)防、控制并最終根除該病是我國當(dāng)前面臨的一項艱巨任務(wù)。采用安全有效的疫苗進(jìn)行免疫預(yù)防，是控制該病的主要措施。本試驗旨在構(gòu)建含(GFP)報

2、告基因的偽狂犬病病毒gG基因缺失表達(dá)載體。 通過酶切、補(bǔ)平、連接的方法對PUSK載體質(zhì)粒進(jìn)行改造，消除了該載體上的BamHI和HindⅢ兩酶切位點。并將改造后的PUSK命名為PUSBH。根據(jù)pAcGFP1-C1基因序列設(shè)計一對引物，分別在引物的上、下游5’端引入了NotI酶切位點，通過PCR擴(kuò)增將目的基因.AcGFP(包括GFP、CMV、MCS、SV40 Poly(A))克隆入pGEM-T-Easy載體內(nèi)，構(gòu)建了重組質(zhì)粒。經(jīng)酶切

3、和PCR鑒定證明插入片段是AcGFP基因，并將重組質(zhì)粒命名為pT-GFP。用NotI酶切重組質(zhì)粒pT-GFP和載體PUSBH并回收，將載體去磷酸化后與目的片段AcGFP鏈接，通過PCR擴(kuò)增、酶切、序列測定證明，該轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建成功。并將其命名為PUSG。該轉(zhuǎn)移載體含有四個單一酶切位點可供外源基因的插入，從而為構(gòu)建以偽狂犬病毒作載體的二價或多價基因工程疫苗打下了基礎(chǔ)。 利用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法，將轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒PUSG與PRV基因組DNA