瘤內應用免疫激活劑增強微波消融治療肝癌免疫效應的實驗研究.pdf

1、肝細胞癌( hepatocellular carcinoma，HCC)是最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在世界上居惡性腫瘤的第五位，而在我國則占據(jù)惡性腫瘤死亡率的第二位。外科手術切除，熱消融和肝移植是目前肝癌根治性治療的主要手段，其中以手術切除為金標準。但是，超過70％的患者在初次就診時因腫瘤進展或肝功能不全而無法接受手術治療，而且手術后復發(fā)率高，復發(fā)后再切除機會低，外科治療的應用受到嚴重限制。熱消融具有創(chuàng)傷小、并發(fā)癥少、可反復多次進行等

2、優(yōu)點，已經成為部分不可手術或者不宜手術治療的肝癌及術后復發(fā)的主要治療手段。但是肝癌行消融治療后復發(fā)率仍較高，因此，如何降低消融術后的復發(fā)率是提高消融治療效果的關鍵。
　　 機體對腫瘤不能產生有效的免疫反應是腫瘤轉移和復發(fā)的最主要原因。抗腫瘤免疫需要腫瘤抗原、抗原提呈細胞(antigen-presenting cells，APCs)和效應細胞的參與。既往研究發(fā)現(xiàn)消融后局部可以產生大量的腫瘤抗原，機體產生強大的、可抑制腫瘤進展的免疫

3、效應。既往研究還發(fā)現(xiàn)，局部高濃度的細胞因子能夠顯著放大已產生的抗腫瘤免疫。將大劑量的生物活性細胞因子(IL-2，IL-12等)注入小鼠活體瘤內，結果產生了保護性免疫，顯著抑制了腫瘤生長。我們已經成功地建立含有小劑量白介素-2(interleukin-2，IL-2)和粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)的緩釋微球。以此作為免疫激活劑，可

4、以刺激機體產生更強大的免疫效應。在前期研究基礎上，我們建立了皮下肝癌模型，在微波消融治療的基礎上應用免疫激活劑，以觀察其對機體免疫效應的影響。
　　 第一部分建立小鼠皮下移植型肝癌消融模型
　　 材料和方法:
　　 1.小鼠皮下移植型肝癌模型的建立：常規(guī)體外培養(yǎng)小鼠Hepa1-6肝癌細胞，按接種細胞數(shù)量不同對小鼠分組。于C57BL/6J小鼠右側脅腰部皮下接種Hepa1-6細胞，建立小鼠皮下移植型肝癌模型，觀察成瘤

5、率，篩選出建立消融的模型最佳細胞數(shù)量。切除皮下移植瘤體做病理檢查。
　　 2.將最佳數(shù)量細胞注射在C57BL/6J小鼠右側脅腰部，觀察皮下腫瘤生長。繪制小鼠皮下移植瘤的生長曲線，建立適合消融的小鼠皮下移植肝癌模型。
　　 3.運用已建立C57BL/6J小鼠Hepa1-6細胞皮下移植肝癌模型，觀察不同消融時間與瘤內溫度或瘤緣溫度的關系，以及不同消融條件下行微波消融后小鼠皮下肝癌移植瘤的30d殘瘤率。
　　 結果:<

6、br>　　 1.皮下注射小鼠Hepa1-6肝癌細胞建立小鼠皮下移植型肝癌模型，適合消融的接種細胞數(shù)量最佳選擇為2×106。
　　 2.接種Hepa1-6細胞后第10 d，小鼠皮下肝癌長徑達到6-8 mm，達到消融的要求。
　　 3.隨消融時間延長，瘤內及瘤緣溫度升高，55℃3min的消融條件能有效滅活小鼠的皮下移植瘤。病理檢查提示消融后腫瘤組織呈壞死干痂樣物，鏡下未見活的癌細胞。消融后腫瘤結節(jié)在第八周內完全消退。

7、>　　 結論:
　　 1、建立了小鼠皮下肝癌消融模型
　　 2、初步掌握了皮下肝癌的最佳消融條件。
　　 第二部分免疫激活劑對熱消融后淋巴細胞增殖的刺激作用
　　 材料和方法:
　　 1.設立兩個對照組：微波消融( MWA)后瘤內注射PBS組和MWA后瘤內注射CytoMPS組，按照第一部分條件建立皮下肝癌消融模型。
　　 2.制備細胞因子緩釋微球( CytoMPS)，消融后第3、7、10

8、天瘤內注射CytoMPS。
　　 3.流式細胞儀檢測外周血淋巴細胞變化：CytoMPS第三次注射后3天后處死小鼠，摘除眼球，經眼動脈取血，肝素抗凝處理，1小時內送流式細胞儀檢測，計算外周血CD4+T細胞、CD8+T細胞變化。
　　 結果:
　　 MWA后原位注射CytoMPS組血液中的CD4+、CD8+T淋巴細胞明顯高于MWA后注射PBS組(P<0.001)。
　　 結論:
　　 MWA后應用免疫

9、激活劑(CytoMPS)對外周血的淋巴細胞增殖有明顯的刺激作用。
　　 第三部分免疫激活劑對熱消融后淋巴細胞功能的增強作用
　　 材料和方法
　　 1.設立兩個對照組：MWA后注射PBS組和MWA-ISV組，按照第一部分條件建立皮下肝癌消融模型。
　　 2.制備細胞因子緩釋微球(CytoMPS)，進行消融后第3、7、10天瘤內注射CytoMPS。
　　 3.疫苗誘導體外CTL的殺瘤活性檢測：Cyt