靶向小鼠肝癌干-祖細(xì)胞免疫治療的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：現(xiàn)有研究表明，腫瘤干細(xì)胞是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要根源之一。雖然手術(shù)、放療和化療等方法能夠有效清除實(shí)體腫塊或減低腫瘤負(fù)荷，取得了一定臨床療效。但腫瘤干細(xì)胞的自我更新、高增殖和耐化療藥等自我保護(hù)的特性，使得常規(guī)手段難以清除組織、血液等機(jī)體內(nèi)殘留的腫瘤干細(xì)胞，成為腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的隱患。
　　過繼細(xì)胞免疫療法(ACI)作為繼手術(shù)、放療、化療之后第四大治療措施已應(yīng)用于臨床腫瘤的治療。2010年針對(duì)去勢(shì)術(shù)后復(fù)發(fā)前列腺癌的DC疫苗研究與

2、臨床應(yīng)用取得了中位生存期延長(zhǎng)的歷史性突破。但至今關(guān)于靶向腫瘤干細(xì)胞的治療性研究特別是免疫治療的報(bào)道很少。由于腫瘤干細(xì)胞與正常組織干細(xì)胞均比較原始且十分相似，免疫細(xì)胞難以識(shí)別，這給靶向腫瘤干細(xì)胞的免疫治療提出了挑戰(zhàn)。我們認(rèn)為，腫瘤組織是由非均質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成的，其中包含數(shù)量極少的干細(xì)胞和初步分化并啟動(dòng)增殖的祖細(xì)胞。這些進(jìn)入快速細(xì)胞分裂狀態(tài)、初步分化的，且保留干性的腫瘤祖細(xì)胞，對(duì)于腫瘤形成和發(fā)展具有重要的生物學(xué)意義；與原始的腫瘤干細(xì)胞相比更能被免

3、疫細(xì)胞有效識(shí)別，具有重要的治療意義。因此，我們假設(shè)腫瘤祖細(xì)胞可以成為腫瘤免疫治療的特異性標(biāo)靶，由其作為抗原誘導(dǎo)的腫瘤免疫治療，可能阻止腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。
　　研究目的：利用干細(xì)胞中ALDH(乙醛脫氫酶)高表達(dá)的特性，在腫瘤細(xì)胞中分選ALDHhigh、ALDHlow及ALDHneg細(xì)胞亞群，鑒定其生物學(xué)特性，以不同干性細(xì)胞亞群作為抗原，制備DC疫苗并誘導(dǎo)腫瘤特異性CTLs，評(píng)價(jià)其治療效果，為靶向腫瘤干/祖細(xì)胞的免疫治療奠定基礎(chǔ)。

4、r>　　研究方法：1)以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠肝癌H22，人胃癌BGC-823、結(jié)腸癌LS-174T、肝癌SMMC-7721細(xì)胞以及胰腺癌SW-1990和Panc-1細(xì)胞系中ALDH+細(xì)胞的表達(dá)；2)在確定ALDH陽性表達(dá)的細(xì)胞中，以ALDH表達(dá)的高低差異，將小鼠肝癌H22細(xì)胞分選并定義為ALDHhigh、ALDHlow、ALDHneg細(xì)胞亞群；3)對(duì)分選出的小鼠肝癌H22細(xì)胞系中三種細(xì)胞亞群進(jìn)行CD133&CD44表型分析；4)對(duì)分選出的

5、小鼠H22三種細(xì)胞亞群進(jìn)行細(xì)胞周期分析；5)將分選出的小鼠肝癌H22各亞群細(xì)胞在干細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，觀察球體形成；6)將分選出的小鼠肝癌H22各亞群細(xì)胞分別以不同數(shù)量級(jí)在小鼠背部皮下注射致瘤，觀察成瘤情況并繪制生長(zhǎng)曲線；7)分別以分選出的小鼠肝癌H22不同亞群細(xì)胞作為抗原制備小鼠CTL細(xì)胞，于H22肝癌細(xì)胞荷瘤昆明小鼠的瘤周進(jìn)行注射，觀察療效，計(jì)算抑瘤率、脾指數(shù)及胸腺指數(shù)。
　　研究結(jié)果：1)在小鼠肝癌H22細(xì)胞、人結(jié)腸癌LS-1

6、74T細(xì)胞、胰腺癌SW-1990細(xì)胞和Panc-1細(xì)胞中存在著ALDH陽性表達(dá)，而在人胃癌BGC-823細(xì)胞和肝癌SMMC-7721細(xì)胞中未見ALDH表達(dá)。2)在小鼠肝癌H22細(xì)胞中能明確分選出存在熒光差異的三群細(xì)胞即ALDHhigh，ALDHlow和ALDHneg細(xì)胞亞群。3)H22細(xì)胞的ALDHhigh，ALDHlow，ALDHneg三個(gè)亞群中CD133&CD44表達(dá)存在差異，其表達(dá)比例依次減少。4)H22細(xì)胞中ALDHhigh曲亞

7、群主要處于G0/G1期，ALDHlow亞群處于s期，而ALDHneg亞群則處于G2/M期；5)ALDHhigh亞群細(xì)胞可形成細(xì)胞球體，ALDHlow和ALDHneg亞群細(xì)胞不能形成球體；6)ALDHlow亞群在接種2×102個(gè)細(xì)胞和2×104個(gè)細(xì)胞時(shí)，腫瘤的生長(zhǎng)趨勢(shì)和平均體積均高于其它兩亞群。7)以ALDHlow亞群細(xì)胞作為抗原制備的小鼠CTL細(xì)胞抑瘤率達(dá)到71％，高于ALDHhigh(56％)和ALDHneg亞群細(xì)胞(51％)(P<0

8、.01)，其脾指數(shù)與胸腺指數(shù)較其它兩亞群增高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　研究結(jié)論：1)在小鼠肝癌H22細(xì)胞、人結(jié)腸癌LS-174T細(xì)胞、胰腺癌SW-1990細(xì)胞和Panc-1細(xì)胞中存在著ALDH陽性的腫瘤干細(xì)胞；2)在小鼠肝癌H22細(xì)胞中能明確分選出干性不同的ALDHhhigh(干細(xì)胞)，ALDHlow(祖細(xì)胞)和ALDHneg(終末細(xì)胞)亞群；3)小鼠肝癌H22細(xì)胞中存在的祖細(xì)胞，是腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵亞群細(xì)胞，且以其為抗原誘導(dǎo)DC制