誘導(dǎo)多能干細(xì)胞與心肌細(xì)胞融合的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、[目的]
　　體外構(gòu)建誘導(dǎo)多能干細(xì)胞與原代心肌細(xì)胞的融合細(xì)胞，初步探討融合細(xì)胞體外生物學(xué)特性。
　　[方法]
　　1.iPSCs細(xì)胞株(IP14D-102)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所(北京干細(xì)胞庫(kù))，iPSCs接種在事先經(jīng)絲裂霉素C處理過(guò)的MEF上，培養(yǎng)基為DMEM-H，包含10％FBS、1000 IU/ml LIF、0.1mmol/Lβ-巰基乙醇、0.1mmol/L L-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸。傳代時(shí)先將重懸液差異

2、貼壁1小時(shí)去除MEF，然后吸取上清液重新接種到新的MEF飼養(yǎng)層上。
　　2.采用0.1％Ⅱ型膠原酶和0.1％胰蛋白酶分次消化乳鼠心肌組織，分離新生小鼠心肌細(xì)胞，體外觀察心肌細(xì)胞生物學(xué)特點(diǎn)，用免疫熒光法鑒定心肌細(xì)胞。
　　3.iPSCs與原代心肌細(xì)胞通過(guò)PEG-4000誘導(dǎo)融合，免疫熒光法鑒定融合細(xì)胞中是否同時(shí)表達(dá)干細(xì)胞和心肌細(xì)胞特異性蛋白。融合細(xì)胞按照標(biāo)準(zhǔn)iPSCs培養(yǎng)條件培養(yǎng)，并在體外觀察融合細(xì)胞生長(zhǎng)特點(diǎn)變化情況，以及體外

3、形成擬胚體的能力檢測(cè)。
　　4.RT-PCR和免疫熒光法檢測(cè)干絀胞、心肌細(xì)胞特異性基因及蛋白在融合細(xì)胞中的表達(dá)情況。染色體核型分析，確定融合細(xì)胞是否發(fā)生細(xì)胞核的融合及程度，以及融合細(xì)胞堿性磷酸酶染色。
　　[結(jié)果]
　　1.飼養(yǎng)層細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形狀貼壁生長(zhǎng)，iPSCs克隆團(tuán)在飼養(yǎng)層細(xì)胞上呈圓形或者橢圓形島狀，細(xì)胞團(tuán)周圍折光性強(qiáng)，其內(nèi)的細(xì)胞間排列緊密，界限和形態(tài)不易區(qū)分。熒光顯微鏡下可見(jiàn)與光學(xué)顯微鏡下相對(duì)應(yīng)的綠色細(xì)胞團(tuán)(Oc

4、t-4-GFP+)。
　　2.心肌細(xì)胞呈三角形、多邊形或者扁平不規(guī)則形態(tài)。培養(yǎng)第3d起，心肌細(xì)胞伸出的偽足相互接觸交織成網(wǎng)，并可見(jiàn)局部呈同步性收縮的心肌細(xì)胞，搏動(dòng)頻率30-50/分鐘。第12天大部分心肌細(xì)胞停止搏動(dòng)，胞漿出現(xiàn)空泡，細(xì)胞皺縮、脫落。細(xì)胞免疫熒光染色后，胞漿內(nèi)可見(jiàn)發(fā)紅色熒光的cTnT。
　　3.PEG-4000能夠介導(dǎo)iPSCs與心肌細(xì)胞融合，融合后第4天開(kāi)始出現(xiàn)成集落狀生長(zhǎng)的細(xì)胞團(tuán)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，均未見(jiàn)到心肌細(xì)

5、胞樣的融合細(xì)胞出現(xiàn)。染色體核型分析顯示，超過(guò)65％的融合細(xì)胞表現(xiàn)出四倍體或者近似四倍體的核型。
　　4.不同時(shí)間點(diǎn)的融合細(xì)胞AKP陽(yáng)性率不完全相同，而融合細(xì)胞的AKP陽(yáng)性率明顯低于同時(shí)間點(diǎn)的iPSCs AKP陽(yáng)性率；P5代以前的融合細(xì)胞同時(shí)表達(dá)干細(xì)胞特異性基因(Oct-4、Nanog)和心肌細(xì)胞特異性基因(α-MHC、β-MHC)，之后的融合細(xì)胞只表達(dá)干細(xì)胞特異性基因；融合細(xì)胞初期Oct-4蛋白與cTnT蛋白均表達(dá)陽(yáng)性，P4代以后