胎血間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)腦缺血大鼠治療作用研究.pdf

1、目的：間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是不同于造血基質(zhì)細(xì)胞的干細(xì)胞群，具有多分化潛能，是骨髓基質(zhì)、骨、軟骨、肌肉、腱、脂肪和結(jié)締組織細(xì)胞的前體細(xì)胞。已有報(bào)道，MSCs存在于骨髓、外周血、臍血等。已證實(shí)骨髓間質(zhì)細(xì)胞具有在特定條件下分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞的能力。Oscar等將人臍血來源的MSCs誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞。與之相比，Mareschi等通過細(xì)胞化學(xué)和分子生物學(xué)法證明

2、骨髓MSCs分化成成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞，而臍血細(xì)胞不能分化且很快死亡。因此，臍血來源MSCs有無此分化能力存在爭(zhēng)議。已有研究神經(jīng)移植可促進(jìn)缺血大腦的再生，胎兒神經(jīng)干細(xì)胞能減輕腦損傷的動(dòng)物和人的行為缺陷，但胚胎移植受倫理限制。MSCs已用于嚴(yán)重成骨不全和癌癥患者的細(xì)胞治療和基因治療，對(duì)于治療其它疾病的研究也相繼展開。MSCs植入正常大鼠腦后能分泌神經(jīng)因子，成為神經(jīng)膠質(zhì)。另外，骨髓細(xì)胞靜脈注射給大腦中動(dòng)脈栓塞(middle cere

3、bral artery occlusion，MCAO)大鼠，可穿過血腦屏障到達(dá)缺血部位并分化成少量星型膠質(zhì)細(xì)胞。全骨髓細(xì)胞和體外培養(yǎng)的MSCs腦內(nèi)移植入MCAO 1天的大鼠和小鼠，可表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞表型并促經(jīng)功能恢復(fù)。但骨髓干細(xì)胞的分化增殖能力會(huì)隨年齡增加而降低，因此有必要尋找其它來源的干細(xì)胞。關(guān)于臍血MSCs在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的存活生長(zhǎng)的研究很少。因此本研究擬探索大鼠胎血MSCs的分離擴(kuò)增，誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞的培養(yǎng)條件；M

4、SCs經(jīng)尾靜脈移植入MCAO的大鼠后觀察其神經(jīng)功能恢復(fù)及植入細(xì)胞的存活、遷移和向神經(jīng)細(xì)胞分化的情況，為臍血干細(xì)胞治療人類缺血性神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：1．MSCs的體外培養(yǎng)無菌條件下，取孕20天大鼠的胎血至含肝素30U/ml的低糖DMEM培養(yǎng)液中。密度梯度離心法收獲單個(gè)核細(xì)胞(monorluclear cells，MNCs)，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate bufferedsaline，PBS)洗滌后接種于含10

5、％胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、青霉素100U/ml、鏈霉素100μg/ml的低糖DMEM培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)。1周后棄掉未貼壁細(xì)胞，以后每周換液2次。擴(kuò)增MSCs的鑒定：α-丁酸萘酚酯酶(α-naphthol butyric acid esterase，NBE)、鹼性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)兩種細(xì)胞化學(xué)染色；流式細(xì)胞儀檢測(cè)MSCs免疫表型CD44、CD54、CDIIb、CD45的表

6、達(dá)情況。 2．MSCs的誘導(dǎo)分化及鑒定 (1)向成骨細(xì)胞分化第5代MSCs，種植于含有0.1 μmol/L地塞米松、10mmol/Lβ一甘油磷酸和0.2mmol/L抗壞血酸的DMEM培養(yǎng)液。細(xì)胞化學(xué)染色茜素紅、堿性磷酸酶檢測(cè)。 (2)向脂肪細(xì)胞分化第5代MSCs，種植于含1 μmol/L氫化考的松、0.5mmol/L異丁基甲基黃嘌呤(3-isobutyl—l—methylxanthine，IBMX)、0.1mm

7、ol/L消炎痛和10％兔血清的DMEM培養(yǎng)液。油紅O染色檢測(cè)脂肪細(xì)胞的形成。 (3)向神經(jīng)細(xì)胞分化 以β-巰基乙醇(β—mercaptoethanol，β—ME)、二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)、叔丁基對(duì)羥基茴香醚(butylatedhydroxyanisole，BHA)定向誘導(dǎo)擴(kuò)增第5代的MSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化，免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物巢蛋白(Nestin)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(ne

8、uron—specific enolase，NSE)、神經(jīng)膠原纖維酸性蛋白(glialfibrillary acidic protein，GFAP)的表達(dá)。 3．MCAO模型的建立和細(xì)胞移植 5溴-2脫氧尿核苷(5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU)標(biāo)記備用的MSCs，移植前流式細(xì)胞儀檢測(cè)BrdU標(biāo)記率、臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MSCs活性。30只雄性成年大鼠MCAO模型分組：移植組通過尾靜脈每只大鼠注射含6×10

9、<'6>個(gè)MSCs的生理鹽水1ml；生理鹽水組注射等量生理鹽水；手術(shù)組不作任何處理。手術(shù)后1、7、14、21、28天采用改良神經(jīng)功能損害評(píng)分(modified neurological severity score，mNSS)對(duì)大鼠進(jìn)行行為學(xué)檢查；組織學(xué)檢測(cè)肝、腎、脾有無免疫排斥反應(yīng)；免疫組織化學(xué)雙染技術(shù)檢測(cè)腦組織切片中BrdU標(biāo)記的MSCs的存活、遷移及其Nestin、GFAP和NSE的表達(dá)。 結(jié)果：1．MSCs體外培養(yǎng)及鑒定

10、 大鼠胎血中存在MSCs且可大量擴(kuò)增，呈成纖維細(xì)胞樣生長(zhǎng)。細(xì)胞化學(xué)染色示其NBE陽性，ALP陰性，流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示MSCs表達(dá)CD44、CD54，不表達(dá)CD11b、CD45。 2．誘導(dǎo)分化及鑒定 (1)向成骨細(xì)胞分化原來梭形MSCs逐漸變寬、平，誘導(dǎo)2周后，茜素紅染色證實(shí)細(xì)胞內(nèi)有鈣沉積，堿性磷酸酶染色陽性。 (2)向脂肪細(xì)胞分化誘導(dǎo)1周后，MSCs可見有脂滴形成，油紅染色陽性。 (3)向神經(jīng)細(xì)

11、胞分化誘導(dǎo)后MSCs形態(tài)學(xué)觀察類似于神經(jīng)元，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其Nestin和NSE陽性，GFAP陰性。 3．MCAO模型的建立和細(xì)胞移植 MSCs移植前，流式細(xì)胞儀檢測(cè)BrdtJ標(biāo)記率為93％，臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MSCs活細(xì)胞率是97.8％。MCAOl4天以后，MSCs移植組大鼠比對(duì)照組的神經(jīng)功能恢復(fù)顯著(P<0.05)。肝、腎、脾組織結(jié)構(gòu)無異常、無免疫排斥反應(yīng)。移植的MSCs細(xì)胞可在大鼠腦組織中存活，并向缺血區(qū)域遷移

12、，BrdU陽性細(xì)胞中(2.88±0.76)％表達(dá)Nestin，(5.24±1.06)％表達(dá)GFAP，(1.34±1.29)％表達(dá)NSE。 結(jié)論：大鼠胎血能夠分離、擴(kuò)增培養(yǎng)出豐富MSCs，在適當(dāng)條件下可向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)元樣細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化。體外擴(kuò)增純化后的MSCs可促進(jìn)局灶性腦缺血大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)，移植細(xì)胞可在大鼠腦缺血區(qū)域中存活、遷移并向神經(jīng)干細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元分化。胎血MSCs具有擴(kuò)增能力強(qiáng)、方便易得、無