Bigelovin對(duì)人上皮性卵巢癌細(xì)胞及外周血單個(gè)核細(xì)胞的體外影響.pdf

1、目的：上皮性卵巢癌(Epithelial Ovarian Cancer，EOC)是女性生殖系統(tǒng)常見(jiàn)的三大惡性腫瘤之一[1]，因缺乏早期診斷方法，五年生存率在3096左右[2-5]。腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)聯(lián)合以鉑類(lèi)和紫杉醇類(lèi)為基礎(chǔ)的化療是EOC的標(biāo)準(zhǔn)治療方法，可大大改善卵巢癌患者的預(yù)后[6-10]。但所有鉑類(lèi)藥物均能引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)，骨髓抑制是最常見(jiàn)的化療副反應(yīng)之一。骨髓抑制嚴(yán)重時(shí)可出現(xiàn)繼發(fā)感染、出血、甚至藥物性再生障礙性貧血，是不良預(yù)后的危險(xiǎn)

2、因素之一。另外，卵巢癌術(shù)后化療耐藥和腫瘤復(fù)發(fā)是卵巢癌治療中又一棘手問(wèn)題[11，12]。一半以上患者死于化療的毒副作用和腫瘤的耐藥復(fù)發(fā)[6，13]，因此尋找低毒高效的化療藥物可能成為解決卵巢癌復(fù)發(fā)和耐藥的有效手段，對(duì)改善患者預(yù)后和提高生活質(zhì)量有重要的臨床意義。
　　 倍半萜烯內(nèi)酯類(lèi)化合物是從植物中提取的一類(lèi)天然倍半萜類(lèi)化合物，廣泛存在于菊科、傘形科、大戟科、衛(wèi)茅科、豆科、葫蘆科和毛莨科中，大多具有一定的生物活性，如抗腫瘤、強(qiáng)心、抗

3、瘧、抗菌、抗急慢性炎癥等[14]。目前對(duì)此類(lèi)物質(zhì)的研究轉(zhuǎn)向了抗腫瘤和逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥方面。Bigelovin屬于倍半萜烯內(nèi)酯類(lèi)化合物，在菊科植物中含量很高。研究發(fā)現(xiàn)bigelovin在體外可抑制人類(lèi)肺癌、激素依賴(lài)性前列腺癌、乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，且對(duì)耐長(zhǎng)春堿的上皮性癌細(xì)胞系具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒作用[15-17]，國(guó)內(nèi)外關(guān)于bigelovin對(duì)人上皮性卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞及正常二倍體細(xì)胞的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外觀察bi

4、gelovin對(duì)人卵巢漿液性囊腺癌細(xì)胞株(SK-OV-3)、人卵巢漿液性囊腺癌順鉑耐藥細(xì)胞株(SK-OV-3/DDP)和外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)增殖及細(xì)胞周期的影響，旨在尋找低毒高效的卵巢癌化療藥物，為克服卵巢癌化療的毒副反應(yīng)和耐藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為抗卵巢癌藥物的體外篩選提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路和實(shí)驗(yàn)方法。
　　 方法：
　　 1、體外培養(yǎng)SK-OV-3和SK-OV-3/DDP細(xì)胞株：將細(xì)胞置于37℃，飽和濕度，5％CO

5、2，含10％胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。
　　 2、密度梯度離心法分離并培養(yǎng)PBMC細(xì)胞：無(wú)菌采集正常肘靜脈肝素抗凝血，D-PBS溶液等比稀釋后，加入淋巴細(xì)胞分離液面離心，取中間白膜層洗滌兩次，用含20％FBS、2％植物血凝素(PHA)的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，臺(tái)盼藍(lán)排斥試驗(yàn)觀察細(xì)胞活力。培養(yǎng)24h后，用不含PHA的新鮮培養(yǎng)液接種細(xì)胞于96孔板中，靜置2h后加藥觀察。

6、
　　 3、倒置顯微鏡觀察：用不同濃度bigelovin作用于SK-OV-3、SK-OV-3/DDP和PBMC細(xì)胞，在倒置相差顯微鏡下定時(shí)觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。
　　 4、MTT比色試驗(yàn)法
　　 4.1選擇不同觀察時(shí)間細(xì)胞的最佳接種密度：觀察在含10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液200μ L條件下，分別以1×104/mL、2×104/mL、3×104/mL、4×104/mL、5×104/mL、6×104/mL、

7、7×104/mL、8×104/mL密度接種的SK-OV-3、SK-OV-3/DDP貼壁后24h、48h、72h的生長(zhǎng)狀況，繪制接種密度-吸光度(OD值)曲線，選擇各觀察時(shí)間細(xì)胞的最佳接種密度。
　　 4.2選擇細(xì)胞的最佳接種方式：以8 mg/L順鉑(DDP)作用于SK-OV-3細(xì)胞為例，在同一96孔板中接種1.5×104/mL、3×104/mL、6×104/mL三種密度的SK-OV-3細(xì)胞，細(xì)胞貼壁后每孔加入等量DDP，使終濃度

8、均為8mg/L。同樣方法制備三個(gè)96孔板，分別培養(yǎng)24h、48h、72h后，MTT法檢測(cè)吸光度，比較相同作用時(shí)間下，細(xì)胞接種密度對(duì)DDP抑制率的影響，選擇細(xì)胞的最佳接種方式。
　　 4.3檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞增殖的影響：按Table1和Table2所示的實(shí)驗(yàn)分組和細(xì)胞接種方式，觀察bigelovin和DDP對(duì)SK-OV-3、SK-OV-3/DDP及PBMC細(xì)胞體外增殖的影響，計(jì)算藥物的半數(shù)抑制濃度(IC50)、耐藥指數(shù)和效能比，評(píng)價(jià)b

9、igelovin對(duì)上皮性卵巢癌細(xì)胞的藥效。
　　 5、流式細(xì)胞術(shù)：碘化丙啶(PI)標(biāo)記的流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)bigelovin對(duì)SK-OV-3和SK-OV-3/DDP細(xì)胞周期的影響。實(shí)驗(yàn)分組如下：Bigelovin(0μ M、2μ M、4μ M、8μ M)作用于SK-OV-3細(xì)胞24h，(0μ M、4μ M、8μ M、16μ M)作用于SK-OV-3/DDP細(xì)胞72h。
　　 6、應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分

10、析。
　　 結(jié)果：
　　 1、倒置顯微鏡觀察：SK-OV-3及SK-OV-3/DDP細(xì)胞均呈貼壁生長(zhǎng)，SK-OV-3細(xì)胞呈梭形，上皮細(xì)胞樣生長(zhǎng)，邊界清楚，折光性好。SK-OV-3/DDP細(xì)胞呈扁平的多角形，“鋪路石”狀，邊界模糊，折光性差。PBMC呈圓形，大小不均一，體積與SK-OV-3及SK-OV-3/DDP細(xì)胞相差較大，靜置2h后可輕微貼壁，但不變形。Bigelovin處理SK-OV-3及SK-OV-3/DDP細(xì)胞后

11、，細(xì)胞密度較對(duì)照組低，光澤度下降，出現(xiàn)細(xì)胞凋亡特征；Bigelovin處理PBMC細(xì)胞24h、48h后細(xì)胞變化不大，72h后細(xì)胞光澤度下降，細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組減少，胞膜皺縮明顯。上述細(xì)胞凋亡變化隨藥物濃度和作用時(shí)間的增加而逐漸明顯。
　　 2、MTT法檢測(cè)結(jié)果
　　 2.1最佳接種密度：在200μ L培養(yǎng)液條件下，SK-OV-3細(xì)胞24h、48h、72h的最佳接種密度分別選擇6×104/mL、3×104/mL、1.5×104

12、/mL；SK-OV-3/DDP細(xì)胞24h、48h、72h的最佳接種密度分別選擇8×104/mL、5×104/mL、3×104/mL；PBMC72h接種密度選擇50×104/mL。
　　 2.2最佳接種方式：同一觀察時(shí)間下，細(xì)胞以最佳密度接種所得的DDP抑制率，與非最佳細(xì)胞密度接種所得的抑制率相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，接種密度對(duì)抑制率有影響；在三個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)最佳接種密度條件下，所得的抑制率標(biāo)準(zhǔn)差均為最小，最佳接種密度

13、下所得的抑制率均數(shù)能更好得代表DDP對(duì)細(xì)胞的抑制作用。故以各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞的最佳接種密度觀察bigelovin和DDP的抑制作用是最佳接種方式。
　　 2.3藥物對(duì)細(xì)胞增殖的影響
　　 2.3.1 DDP：DDP對(duì)SK-OV-3細(xì)胞系24h、48h、72h的IC50分別為14.622mg/L、7.999 mg/L、2.176mg/L；對(duì)SK-OV-3/DDP細(xì)胞系24h、48h、72h的IC50分別為23.375 mg/L、

14、13.695 mg/L、4.899mg/L，對(duì)PBMC細(xì)胞72h的IC50為14.922 mg/L。SK-OV-3/DDP細(xì)胞系的DDP平均耐藥指數(shù)為1.854，小于建株者提供的耐藥指數(shù)。DDP作用72h對(duì)SK-OV-3細(xì)胞的效能比為6.858，對(duì)SK-OV-3/DDP細(xì)胞的效能比為3.046。在一定時(shí)間和濃度范圍內(nèi)，DDP對(duì)卵巢癌細(xì)胞抑制作用存在時(shí)間一劑量依賴(lài)性，對(duì)正常二倍體細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用存在劑量依賴(lài)性。
　　 2.3.2

15、 Bigelovin：Bigelovin對(duì)SK-OV-3細(xì)胞24h、48h、72h的IC50分別為6.643μ M、2.176μ M、0.940μ M；對(duì)SK-OV-3/DDP細(xì)胞的IC50分別為70.352μM、44.573μ M、15.933μ M；對(duì)PBMC細(xì)胞72h的IC50為21.933μ M。Bigelovin對(duì)SK-OV-3/DDP細(xì)胞24h、48h時(shí)IC50大于其體外藥效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)32.895μ M，故僅作用72h評(píng)價(jià)為有

16、效。SK-OV-3/DDP細(xì)胞系對(duì)bigelovin的耐藥指數(shù)為16.950，是DDP耐藥指數(shù)的8.634倍；Bigelovin作用72h對(duì)SK-OV-3細(xì)胞的效能比為23.333，對(duì)SK-OV-3/DDP細(xì)胞的效能比為1.377。在一定時(shí)間和濃度范圍內(nèi)，bigelovin對(duì)DDP敏感卵巢癌細(xì)胞抑制作用存在時(shí)間一劑量依賴(lài)性，對(duì)DDP耐藥上皮性卵巢癌細(xì)胞和正常細(xì)胞的抑制作用存在劑量依賴(lài)性。
　　 3、FCM檢測(cè)顯示：Bigelov

17、in可將SK-OV-3和SK-OV-3/DDP細(xì)胞阻滯于G2/M期，且G2/M期和S+G2/M期細(xì)胞比例隨藥物濃度的升高而升高。
　　 結(jié)論：
　　 1、用MTT比色法進(jìn)行體外抗癌藥物篩選時(shí)，接種密度對(duì)藥物的抑制率有影響，應(yīng)選擇各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞的最佳接種密度觀察藥物的抑制作用；
　　 2、卵巢癌體外抗癌藥物篩選不應(yīng)選擇正常卵巢上皮細(xì)胞或正常子宮內(nèi)膜細(xì)胞作為二倍體對(duì)照，外周血單個(gè)核細(xì)胞是一個(gè)較理想的選擇；
　　

18、 3、Bigelovin對(duì)DDP敏感型上皮性卵巢癌(EOC)細(xì)胞株的選擇性抑制作用優(yōu)于DDP，可進(jìn)一步做體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，以明確其對(duì)DDP敏感型EOC的治療作用；
　　 4、Bigelovin對(duì)DDP耐藥型EOC細(xì)胞株的抑制作用較差，與DDP存在交叉耐藥，不宜單獨(dú)用于DDP耐藥EOC的治療；
　　 5、Bigelovin可將SK-OV-3和SK-OV-3/DDP細(xì)胞系阻滯于G2/M期，可能是bigelovin抑制EOC細(xì)胞增殖的