CD147在類風濕關節(jié)炎中性粒細胞中的表達及作用研究.pdf

1、【目的】
　　類風濕關節(jié)炎（rheumatoid arthritis,RA）是一種以滑膜增殖和骨質破壞為主要特征的慢性炎性疾病。目前認為成纖維樣滑膜細胞（fibroblast-likesynovialcell,FLS）在空間占位的同時，也可以通過分泌大量的基質金屬蛋白酶（matrixmetalloproteinases,MMPs）達到破壞軟骨的目的。在RA關節(jié)腔內(nèi)存在大量的炎細胞，其中滑液中含量最豐富的細胞是中性粒細胞，它的代謝產(chǎn)

2、物水平可以作為反映病情活動度的指標之一。CD147分子，是一種分子量約在57KD左右的跨膜糖蛋白，因其在促進MMPs分泌中具有重要意義，也被稱為胞外基質金屬蛋白酶誘導劑（extracellularmatrixmetalloproteinaseinducer,EMMPRIN）。本實驗室前期發(fā)現(xiàn)在RA滑膜細胞表面CD147分子高表達，促進其MMPs的分泌和活化，同時增強侵襲能力。但是，在細胞與細胞間相互作用中如何促進MMPs分泌增加的機制尚

3、不清楚。為了觀察CD147分子在中性粒細胞表面的表達水平及其功能，我們進行了以下研究。
　　【方法】
　　采用FACS流式細胞儀分析細胞表面CD147表達陽性率及平均熒光強度（meanfluorescenceintensity,MFI），CellQuest軟件進行數(shù)據(jù)分析。采用實時-定量PCR技術測定MMP-1，-2，-3，-9和CD147的mRNA表達量，MxProQPCR軟件進行數(shù)據(jù)分析。利用改良的48孔Boyden小室

4、進行趨化實驗，親環(huán)素A（cyclophilinA,CyPA）做趨化劑，同時在細胞中加入抗CD147單抗觀察其阻斷效果。采用明膠酶譜法檢測細胞培養(yǎng)基中MMP-2和MMP-9的表達及活化情況。采用酶聯(lián)免疫吸附實驗（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）測定MMP-1和MMP-3的表達量。細胞侵襲實驗使用Boyden小室進行。采用激光共聚焦掃描顯微鏡測定HL-60細胞中游離Ca2+濃度，粘附實驗檢測細胞與

5、胞外基質的粘附能力，并用westernblot方法檢測脂筏中TRPM-7的表達變化情況。上述實驗均重復至少3次。采用Graphpad軟件進行數(shù)據(jù)分析，P<0.05認為有統(tǒng)計學差異。
　　【結果】
　　1．CD147在RA滑膜細胞表面陽性表達率高于骨關節(jié)炎（osteoarthritis,OA）滑膜細胞對照組。HL-60細胞經(jīng)誘導分化后CD147表達的MFI量顯著增加。自RA外周血中分離的中性粒細胞CD147表達的MFI量較自健

6、康對照者外周血中分離的中性粒細胞表達高。自RA滑液中分離的中性粒細胞CD147表達的MFI量較自RA外周血中分離的中性粒細胞顯著增高。
　　2．RA滑膜細胞中MMP-1，-2，-3，-9和CD147的mRNA表達量較OA對照組顯著增加，與HL-60細胞共培養(yǎng)后增加明顯。HL-60細胞經(jīng)誘導分化后MMP-1，-2，-3，-9和CD147的mRNA表達量均較誘導分化前增加。
　　3．由CyPA介導的趨化作用在誘導分化后HL-60

7、細胞中較誘導分化前增加明顯。在加入抗CD147抗體組中趨化數(shù)目降低明顯。
　　4．明膠酶譜和ELISA結果均顯示RAFLS中MMPs的表達量較OAFLS對照組顯著增加。誘導分化后的HL-60細胞較誘導分化前顯著增加。RAFLS與誘導分化后的HL-60細胞共培養(yǎng)后的MMPs表達量較與誘導分化前共培養(yǎng)組顯著增加。經(jīng)抗CD147抗體作用后，MMPs表達量顯著降低，無關抗體對照組則無顯著變化。
　　5．明膠酶譜和ELISA結果顯示R

8、AFLS與RA外周血中性粒細胞或健康對照者外周血中性粒細胞共培養(yǎng)后，MMPs表達量均較RAFLS單獨培養(yǎng)組顯著增加；且與RA外周血中性粒細胞共培養(yǎng)組增加更明顯。加入抗CD147單抗后MMPs表達量降低明顯，無關單抗組中無此現(xiàn)象。
　　6．RAFLS與RA滑液中性粒細胞共培養(yǎng)后MMPs表達量較RAFLS單獨培養(yǎng)組或其與RA外周血中性粒細胞共培養(yǎng)組增加，加入CD147單抗后MMPs表達量顯著降低，無關單抗組則無此作用。
　　7．

9、侵襲實驗證實RAFLS侵襲數(shù)目較OAFLS對照組顯著增加，與誘導分化后HL-60共培養(yǎng)后侵襲數(shù)目較誘導分化前顯著增加，且均較RAFLS單獨培養(yǎng)組增加明顯。RAFLS與RA外周血中性粒細胞共培養(yǎng)后較與健康對照者外周血中性粒細胞共培養(yǎng)組相比，侵襲數(shù)目顯著增加。RAFLS與RA滑液中性粒細胞共培養(yǎng)后較與RA外周血中性粒細胞共培養(yǎng)組相比，侵襲數(shù)目顯著增加。加入CD147單抗后侵襲數(shù)目顯著降低，無關單抗組則無此作用。
　　8．胞內(nèi)鈣離子測定

10、及粘附實驗表明經(jīng)CyPA刺激后，胞內(nèi)Ca2+濃度及細胞粘附能力顯著增加，加入CD147單抗后這種作用被阻斷，Westernblot結果提示可能與脂筏層中TRPM-7蛋白發(fā)揮功能有關。
　　【結論】
　　1．本研究發(fā)現(xiàn)CD147表達量在HL-60細胞誘導分化后顯著增加。明膠酶譜及ELISA檢測顯示分化成熟后的HL-60細胞MMPs表達量顯著增加。在細胞分化過程中檢測到的CD147高表達與MMPs高表達相關，由此導致的MMPs及

11、其抑制因子之間的失衡可能導致了RA的關節(jié)破壞。
　　2．為了觀察細胞間相互作用在MMPs產(chǎn)生及RAFLS侵襲中的作用，我們將RAFLS與HL-60細胞進行了共培養(yǎng)。明膠酶譜和ELISA實驗均證實RAFLS經(jīng)與HL-60細胞共培養(yǎng)后，較各自單獨培養(yǎng)組MMPs表達量顯著增加。細胞侵襲實驗也證實高表達CD147的中性粒細胞可能通過與RAFLS相互作用在RA發(fā)病中發(fā)揮重要作用。
　　3．為了模擬RA患者體內(nèi)最真實情況，我們自RA外周

12、血及滑液中分離了中性粒細胞，與RAFLS進行共培養(yǎng)。結果與RAFLS及HL-60細胞共培養(yǎng)體系有類似的趨勢，提示在體內(nèi)高表達的CD147發(fā)揮了促進MMPs產(chǎn)生的作用，同時可以增強RAFLS的侵襲能力。
　　4．CD147單抗可以顯著抑制MMPs的產(chǎn)生及RAFLS的侵襲能力，提示阻斷CD147后，MMPs的產(chǎn)生及RAFLS的侵襲能力均被抑制。
　　5．趨化實驗證實CyPA對中性粒細胞有顯著的趨化作用，這種趨化作用可以被CD14

13、7單抗所阻斷，提示CyPA可能作為CD147的配體在高表達CD147的炎細胞募集過程中發(fā)揮作用。
　　6．CD147分子可能通過TRPM-7蛋白參與了由CyPA誘導的胞內(nèi)鈣離子濃度升高，增強中性粒細胞與細胞外基質的粘附，CD147抗體可將其阻斷。
　　7．總之，我們的研究發(fā)現(xiàn)了在RA中性粒細胞高表達的CD147分子可能與CyPA介導的中性粒細胞趨化，RAFLS的MMPs分泌及其侵襲能力有關，上述功能均與RA軟骨侵襲及骨質破壞