熒光定量RT-PCR檢測(cè)人TGF-β1 mRNA方法學(xué)建立及初步臨床應(yīng)用.pdf

1、本文采用TaqMan-MGB技術(shù)，建立熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(FQ-RT-PCR)方法，檢測(cè)慢性肝病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1mRNA)表達(dá)水平，并分析其表達(dá)水平的變化與肝病肝纖維化的關(guān)系。 方法1.在TGF-β1基因的外顯子1和2之間設(shè)計(jì)一對(duì)引物和一條TaqMan-MGB探針，傳統(tǒng)PCR擴(kuò)增TGF-β1的102bp產(chǎn)物片斷，產(chǎn)物純化后與pUC-T載體連接，構(gòu)建TGF-β1重組質(zhì)粒克隆。

2、2.用HindⅢ單酶切重組質(zhì)粒使質(zhì)粒完全線性化，以線性化的質(zhì)粒為模板，加入T7RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄合成帶有目的片斷的cRNA，使用無(wú)RNase的DNaseⅠ消化質(zhì)粒，乙醇沉淀的cRNA作為FQ-RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)品。3.在PCR反應(yīng)體系中加入與模板互補(bǔ)的TaqMan-MGB探針，根據(jù)10倍系列稀釋cRNA標(biāo)準(zhǔn)濃度對(duì)數(shù)和其循環(huán)域值(Cyclethreshold,Ct)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立熒光定量RT-PCR檢測(cè)PBMC中TGF-β1mRNA含

3、量的方法。并對(duì)本方法進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)，包括敏感度、線性范圍、特異性、重復(fù)性和探針的穩(wěn)定性。4.收集慢性肝病患者外周血標(biāo)本，應(yīng)用FQ-RT-PCR定量檢測(cè)PBMC中TGF-β1mRNA表達(dá)水平，應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)血漿TGF-β1水平，同時(shí)應(yīng)用放射免疫分析方法檢測(cè)血清透明質(zhì)酸(HA)、Ⅲ型前膠原蛋白(PCⅢ)、Ⅳ型膠原(CⅣ)。 研究表明，以cRNA為標(biāo)準(zhǔn)曲線的熒光定量RT-PCR檢測(cè)TGF-β1mRNA具有敏感、特異、快速等特點(diǎn)