豬卵丘細(xì)胞核移植的核質(zhì)關(guān)系研究.pdf

1、體細(xì)胞的核移植是一項(xiàng)復(fù)雜而又實(shí)用的胚胎工程技術(shù)，不管是在基礎(chǔ)理論，還是在應(yīng)用研究中都具有很大的價(jià)值。核移植技術(shù)最早是為了研究細(xì)胞分化中遺傳物質(zhì)所起的作用而提出的，也就是為了研究核質(zhì)之間關(guān)系的問題。然而到核移植技術(shù)日趨成熟，并已得到克隆動(dòng)物的今天，核移植過(guò)程中核質(zhì)之間的相互關(guān)系卻仍然未徹底弄清楚。本研究以豬卵丘細(xì)胞作為供核細(xì)胞，體外成熟培養(yǎng)的MII期豬卵母細(xì)胞為受體，對(duì)預(yù)激活受體胞質(zhì)、激活程序、核質(zhì)作用時(shí)間、卵丘細(xì)胞不同處理方式進(jìn)行了研究

2、，同時(shí)為了得到較好的核移植受體，對(duì)不同直徑卵泡對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟的影響也進(jìn)行了預(yù)試驗(yàn)研究。本研究旨在通過(guò)對(duì)成熟卵母細(xì)胞核移植受體移核前后不同時(shí)間進(jìn)行激活，并與核移植供體細(xì)胞的周期調(diào)控相關(guān)內(nèi)容相結(jié)合，研究供核細(xì)胞和受核卵母細(xì)胞之間核質(zhì)關(guān)系，以便提高核移植效率。根據(jù)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的分析，得到以下幾點(diǎn)結(jié)論： 1.不同直徑卵泡對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟的影響：由直徑分別為＜3mm、3～6mm、＞6mm的卵泡中抽出COCs，以第一極體的排出作為豬卵母

3、細(xì)胞成熟的標(biāo)志，研究不同直徑的卵泡對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟的影響。試驗(yàn)結(jié)果：成熟率最高的為3～6mm組(195/412，47.26±0.98﹪)，其次為＞6mm組(66/204，43.24±4.30﹪)，最低為＜3mm組(24/196，12.20±0.96﹪)，三組之間差異為極顯著(P＜0.01)。結(jié)果表明，選擇3～6mm組卵泡抽卵試驗(yàn)效果最佳。 2.預(yù)激活去核卵母細(xì)胞胞質(zhì)對(duì)核移植效果的影響：本試驗(yàn)把去核后的受體胞質(zhì)進(jìn)行預(yù)激活或無(wú)激

4、活處理，然后再進(jìn)行直接注核操作，以重構(gòu)胚的卵裂率與4細(xì)胞以上胚胎率為指標(biāo)(下同)，比較兩種方法對(duì)核移植效果的影響。試驗(yàn)結(jié)果：無(wú)預(yù)激活胞質(zhì)組在卵裂率和4細(xì)胞以上胚胎率都比預(yù)激活胞質(zhì)組高(63/177，35.53±3.32﹪vs45/137，32.80±3.05﹪；22/177，12.40±1.20﹪vs15/137，10.80±3.00﹪)，但是兩組在兩個(gè)指標(biāo)上都差異不顯著(P＞0.05)。結(jié)果表明，卵丘細(xì)胞核移植過(guò)程中不需要對(duì)去核胞質(zhì)進(jìn)

5、行預(yù)激活。 3.核移植過(guò)程中同時(shí)激活與延遲激活對(duì)核移植效果的影響：本試驗(yàn)把卵丘細(xì)胞注入去核成熟卵母細(xì)胞的卵周隙中，比較融合與激活同時(shí)進(jìn)行或分別進(jìn)行對(duì)核移植效果的影響。試驗(yàn)結(jié)果：延遲激活在卵裂率和4細(xì)胞以上胚胎率上都比同時(shí)激活的高(56/151，37.11±2.25﹪vs52/146，35.66±0.81﹪；16/151，10.49±2.06﹪vs12/146，8.17±1.33﹪)，但是兩組在兩個(gè)指標(biāo)上都差異不顯著(P＞0.05

6、)。結(jié)果表明，從實(shí)驗(yàn)效率來(lái)看，卵周隙注核所得的重構(gòu)胚可以選擇同時(shí)激活。 4.不同核質(zhì)作用時(shí)間對(duì)核移植效果的影響：在核移植胚胎重構(gòu)后，供體細(xì)胞核在高活性MPF受體卵母細(xì)胞質(zhì)內(nèi)分別作用0h、1.5h、3.0h、4.5h、6.0h、7.5h后，再將重構(gòu)胚激活，比較不同核質(zhì)作用時(shí)間對(duì)核移植效果的影響。試驗(yàn)結(jié)果：從卵裂率來(lái)看核質(zhì)作用時(shí)間7.5h組(39/104，37.47±2.05﹪)最高，與1.5h(42/124，33.94±1.78﹪

7、)、3.0h(41/115，35.70±1.44﹪)、4.5h(45/124，36.30±2.09﹪)、6.0h(39/111，34.94±4.18﹪)組的差異不顯著(P＞0.05)，而0h(15/118，12.64±2.48﹪)組最低，與其它組差異極顯著(P＜0.01)；從4細(xì)胞以上胚胎率來(lái)看，原本卵裂率較高的7.5h組(8/104，7.61±2.31﹪)有所下降，與其它組差異顯著(P＜0.05)，1.5h(13/124，10.42±

8、1.66﹪)、3.0h(13/115，11.30±2.12﹪)、4.5h(15/124，12.04±2.37﹪)、6.0h(13/111，11.53±2.94﹪)組較高，之間差異不顯著(P＞0.05)，0h組(2/118，1.71±2.35﹪)最低，與其它組差異極顯著(P＜0.01)。結(jié)果表明，核質(zhì)作用時(shí)間3～6h對(duì)核移植效果比較有利。 5.卵丘細(xì)胞不同處理方式對(duì)核移植效果的影響：以豬卵丘細(xì)胞作為供核細(xì)胞，比較了供核細(xì)胞傳代與不

9、傳代、使用A23187與乙醇預(yù)處理對(duì)核移植效果的影響。 (1)比較培養(yǎng)的卵丘細(xì)胞和直接分離的卵丘細(xì)胞作為供核細(xì)胞對(duì)核移植的影響：本試驗(yàn)作為供核細(xì)胞的卵丘細(xì)胞有兩種。其一，是直接從成熟卵母細(xì)胞周圍分離所得；其二，是直接分離所得的卵丘細(xì)胞經(jīng)過(guò)體外培養(yǎng)傳代4代的，比較兩種供核的核移植效果。試驗(yàn)結(jié)果：傳代與不傳代的卵丘細(xì)胞作供體在卵裂率(43/126，34.12±2.14﹪vs56/158，35.32±4.99﹪)與4細(xì)胞以上胚胎率(1

10、3/126，10.29±1.90﹪vs18/158，11.30±3.10﹪)差異都不顯著(P＞0.05)。結(jié)果表明，可以以直接分離所得的卵丘細(xì)胞作核移植的受體。 (2)不同的供核細(xì)胞預(yù)處理方法對(duì)核移植效果的影響：本試驗(yàn)以無(wú)預(yù)處理作對(duì)照組，使用乙醇(7﹪)，A23187(5μmol/L)預(yù)處理供核細(xì)胞后再進(jìn)行核移植，比較其對(duì)核移植效果的影響。試驗(yàn)結(jié)果：A23187預(yù)處理組(58/145，39.94±1.28﹪)的卵裂率最高，與乙醇

11、處理組(42/118，35.82±2.50﹪)、對(duì)照組(58/166，34.65±4.33﹪)的差異顯著(P＜0.05)，而乙醇與對(duì)照組則差異不顯著(P＞0.05)；A23187處理組(23/145，15.70±2.94﹪)的4細(xì)胞以上胚胎率仍為最高，與乙醇處理組(16/118，13.43±2.42﹪)的差異不顯著(P＞0.05)，而與對(duì)照組(20/166，12.00±1.39﹪)則差異顯著(P＜0.05)，乙醇處理組與對(duì)照組則差異不顯

12、著(P＞0.05)。結(jié)果表明，A23187預(yù)處理供體細(xì)胞效果最佳。 驗(yàn)結(jié)果：延遲激活在卵裂率和4細(xì)胞以上胚胎率上都比同時(shí)激活的高(56/151，37.11±2.25﹪vs52/146，35.66±0.81﹪；16/151，10.49±2.06﹪vs12/146，8.17±1.33﹪)，但是兩組在兩個(gè)指標(biāo)上都差異不顯著(P＞0.05)。結(jié)果表明，從實(shí)驗(yàn)效率來(lái)看，卵周隙注核所得的重構(gòu)胚可以選擇同時(shí)激活。 綜上所述：在豬卵母細(xì)