補(bǔ)益營衛(wèi)方對衰老人皮膚成纖維細(xì)胞活力影響的實驗研究.pdf

1、目的：觀察補(bǔ)益營衛(wèi)方對人皮膚成纖維細(xì)胞（HSF）活力的影響作用；觀察不同濃度補(bǔ)益營衛(wèi)方含藥血清對人皮膚成纖維細(xì)胞（HSF）所具有的延緩衰老作用；探討其可能的作用機(jī)制。
　　方法：
　　1細(xì)胞培養(yǎng)：從昆明細(xì)胞庫購得健康人皮膚成纖維細(xì)胞，傳代接種于培養(yǎng)瓶中，并進(jìn)行40代的傳代，使其成為老化細(xì)胞。
　　2含藥血清的制備：雄性清潔級SD大鼠60只,體重在300±50g,隨機(jī)分為補(bǔ)益營衛(wèi)低劑量組、補(bǔ)益營衛(wèi)中劑量組和補(bǔ)益營衛(wèi)高劑量

2、組，各給藥組依次按照1.5g∕Kg、3g∕Kg、6g∕Kg灌胃，每日兩次，連續(xù)一周，第8天末次給藥1小時后，10％水合氯醛腹腔注射麻醉，無菌操作心臟采血，室溫靜置2小時，2500rpm離心15分鐘，取出血清，超凈臺無菌過濾，56℃滅活30分鐘，-80℃冰箱中保存?zhèn)溆眉礊樗幬镅?，分別為補(bǔ)益營衛(wèi)低劑量組血清、補(bǔ)益營衛(wèi)中劑量組血清、補(bǔ)益營衛(wèi)高劑量組血清。用時以DMEM培養(yǎng)基將血清稀釋為10％的培養(yǎng)液。
　　3補(bǔ)益營衛(wèi)方的制備：補(bǔ)益營衛(wèi)

3、方由人參、生黃芪、炙甘草組成。濃度單位（g生藥/ml），終濃度為4g/ml。
　　4細(xì)胞生長曲線測定：細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液后，調(diào)整細(xì)胞濃度至2.5×104/ml，接種于24孔培養(yǎng)板中。待細(xì)胞貼壁后，藥物處理。每天每組取3孔細(xì)胞，用細(xì)胞計數(shù)板進(jìn)行計數(shù)，計算平均值。每3天給未計數(shù)的細(xì)胞換液。連續(xù)計數(shù)8天，以細(xì)胞培養(yǎng)天數(shù)為橫軸，細(xì)胞數(shù)為縱軸，繪制細(xì)胞增殖生長曲線。
　　5細(xì)胞增殖活性的檢測：用MTT法檢測各實驗組細(xì)胞的增殖活性。<

4、br>　　6 p38、JNK和ERK1/2蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)檢測：將細(xì)胞用0.25％胰蛋白酶消化。制成單細(xì)胞懸液。以5×104個/孔的密度接種于預(yù)先放有消毒蓋玻片的6孔培養(yǎng)板內(nèi)，置于37℃、5％CO2孵箱中孵育24h后，0.01mmol∕L的PBS洗2次。加入適當(dāng)固定劑固定細(xì)胞以檢測藥物血清對p38、JNK和ERK1/2等表達(dá)的影響。實驗設(shè)立陰性對照，不加一抗。
　　結(jié)果：
　　1補(bǔ)益營衛(wèi)方含藥血清對HSF的生長具有促進(jìn)作用。

5、并能有效延緩HSF的衰老進(jìn)程。補(bǔ)益營衛(wèi)低劑量組、補(bǔ)益營衛(wèi)中劑量組、補(bǔ)益營衛(wèi)高劑量組與年輕對照組和老齡對照組相比均P<0.05。
　　2不同濃度的補(bǔ)益營衛(wèi)方含藥血清均能增加HSF的增殖活性，與兩個對照組相比均有顯著性差異（P<0.05）；不同濃度的補(bǔ)益營衛(wèi)含藥血清組之間對HSF的延緩衰老作用是：高劑量組優(yōu)于中劑量組，中劑量組優(yōu)于低劑量組。(P<0.05)。
　　結(jié)論：不同濃度的補(bǔ)益營衛(wèi)含藥血清對HSF均有延緩衰老的作用，且補(bǔ)益