VSMC BKCa活性改變與衰老相關(guān)基因p16、p21關(guān)系的研究.pdf

1、目的：觀察動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)大電導(dǎo)鈣激活鉀通道(large conductance Ca2+-activeted K+ channels，BKCa)的活性改變對(duì)平滑肌細(xì)胞衰老和衰老相關(guān)基因p16、p21表達(dá)的影響，以探討B(tài)KCa活性改變?cè)趧?dòng)脈血管老化發(fā)病學(xué)中的意義，并進(jìn)一步闡述動(dòng)脈老化發(fā)生的分子機(jī)制。 方法：(1)二級(jí)清潔雄性SD大鼠，青年組和老年組各12只，采用

2、酶消化法對(duì)動(dòng)脈平滑肌進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定平滑肌細(xì)胞α-action。選取第2代平滑肌細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每只大鼠均設(shè)立BKCa激活劑(NS1619)組、BKCa阻斷劑(Iberiotoxin，IBTX)組和對(duì)照組(未被干擾組)。(2)用β-半乳糖苷酶染色法對(duì)上述VSMC進(jìn)行衰老細(xì)胞染色，初步觀察不同年齡組BKCa的活性改變對(duì)血管平滑肌細(xì)胞衰老的影響。(3)用RT-PCR方法對(duì)上述VSMC的p16和p21基因表達(dá)水平進(jìn)行半定量分析，觀

3、察不同年齡動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BKCa活性改變與衰老相關(guān)基因p16、p21關(guān)系。 結(jié)果：(1)倒置顯微鏡下，培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞形態(tài)為長(zhǎng)梭形，呈現(xiàn)平滑肌細(xì)胞典型的“峰"、“谷”樣生長(zhǎng)。免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定細(xì)胞純度為98％。(2)β半乳糖苷酶染色電鏡下觀察，不論青年組或是老年組，加入BKCa激活劑后衰老的平滑肌細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組顯著減少，加入BKCa阻斷劑后衰老細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；BKCa激活劑組、對(duì)照組和

4、BKCa阻斷劑組衰老平滑肌細(xì)胞數(shù)量在老年組均較青年組多，衰老細(xì)胞染色陽性率在青年組和老年組之間差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；年齡和BKCa活性的改變對(duì)細(xì)胞衰老的影響存在著交互作用(P＜0.01)，BKCa的活性改變對(duì)老年組的影響更加明顯。(3)PCR結(jié)果顯示，無論是青年大鼠還是老年大鼠的動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，在加入BKCa激活劑后p16表達(dá)水平較對(duì)照組明顯減少，加入BKCa阻斷劑后p16表達(dá)水平較對(duì)照組明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

5、P＜0.05)；BKCa激活劑組、BKCa阻斷劑組和對(duì)照組培養(yǎng)的VSMC細(xì)胞在青年組和老年組均可檢測(cè)到p21的表達(dá)，且老年組平滑肌細(xì)胞p21表達(dá)水平明顯高于青年組(P＜0.05)，而BKCa活性改變對(duì)p21表達(dá)無影響，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 結(jié)論：(1)NS1619可以抑制平滑肌細(xì)胞衰老，IBTX則促進(jìn)平滑肌細(xì)胞衰老，這說明隨著血管的老化，BKCa的基因表達(dá)減少，活性降低，這反過來又引起平滑肌細(xì)胞衰老程度的增加。(2

6、)NS1619可以顯著抑制大鼠動(dòng)脈VSMC p16基因的表達(dá)，IBTX則顯著增加VSMC p16基因的表達(dá)，而BKCa的活性改變對(duì)VSMC p21表達(dá)無影響，這種BKCa的活性改變對(duì)VSMC p16基因表達(dá)的影響可能是血管老化的分子機(jī)制之一。BKCa可能是通過p16INK4a/Rb/MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑影響著血管的老化。(3)無論BKCa活性改變與否，老年組衰老細(xì)胞染色陽性率大于青年組，其p16和p21基因表達(dá)也較青年組明顯，提示增齡本