新型白蛋白納米粒-乙肝DNA疫苗的研究.pdf

1、本研究將微生物學、免疫學、分子生物學和生物材料學等多個學科有機結合起來，采用基于表位的疫苗設計的方法，運用基因重組技術構建了治療性的乙肝DNA疫苗；并對疫苗的生產(chǎn)工藝和質量控制標準進行了研究；輔以納米的基因疫苗運載體統(tǒng)后，將制備好的疫苗納米緩釋系統(tǒng)免疫小鼠，初步考察疫苗激發(fā)的細胞免疫反應。本研究包括五個部分： 第一章疫苗的設計與構建 本研究是基于表位的疫苗設計(EPITOPE-BASED VACCINEDESIGN，EB

2、VD)，以多表位基因疫苗的方式入手，構建HBV基因疫苗。首先篩選靶抗原，即通過高分辨率的表位圖譜及計算機輔助設計的手段預測并篩選表位，選取一組具有較強免疫原性的多種殺傷性T細胞表位及B細胞表位，進行有機的組合；輔以一定的旁側序列連接這些表位以保證在真核細胞中能正確表達并加工成有效的多肽片段。 pVAX1真核表達質粒是FDA批準的能用于臨床試驗的載體，含有豐富的CpG序列，通過化學合成得到目的基因片斷，并采用限制性內切酶技術和基因

3、重組技術將目的片斷克隆入pVAX1真核表達載體，通過酶切、PCR及測序的方法鑒定目的片斷已成功插入，得到重組質粒pVAX/HS，為下一步工作奠定了基礎。 第二章疫苗的發(fā)酵與純化工藝的研究 從培養(yǎng)基配方、pH值及溶氧等方面對發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，用層析的方法對發(fā)酵產(chǎn)物進行大規(guī)模純化，以得到大量的疫苗產(chǎn)品來滿足實驗需要。 首先采用了單因素考察的實驗方法，找到了適合的碳源、氮源、磷源、鎂離子及較適水平，考慮到各因素間可能存

4、在的交互影響作用，運用SAS軟件安排中心組合實驗并進行響應面分析，回歸擬合中心組合實驗數(shù)據(jù)，可以得到能與實際情況擬合良好的模型方程，進而可知最適的培養(yǎng)基成份。其次，在搖瓶分批發(fā)酵實驗的基礎上，進行補料分批發(fā)酵研究。發(fā)現(xiàn)溶氧與底物消耗密切相關，建立了利用溶氧反彈來確定補料時機的模式，并在20L發(fā)酵罐中進行補料分批發(fā)酵實驗，采用恒速流加甘油的方式可以在一定程度上解除高濃度底物的抑制效應，提高甘油的利用率，同時使菌體處于合適的底物濃度。最后，

5、通過分子篩與陰離子交換層析的方法，去除裂菌后質粒疫苗中的宿主RNA、開環(huán)的質粒DNA及內毒素等主要污染物。 本實驗得到的攜帶有質粒疫苗的工程菌較適發(fā)酵培養(yǎng)基配方為(g/L)：甘油1.0、蛋白胨33.1、酵母抽提物5.0、KH2PO4 13.7、MgSO4.7H2O1.5。經(jīng)優(yōu)化后，生物量在初始培養(yǎng)基的基礎上提高了2.8倍。采用該模式進行補料取得了良好的效果，得到生物量達69.8g/L，比批次發(fā)酵提高22％。通過層析的方法，去除了

6、主要雜質，純化并濃縮得到了大量的目的基因質粒。 第三章DNA疫苗質量控制的研究 作為核酸疫苗的質粒上設計有大腸桿菌復制起始位點，本實驗采用大腸桿菌發(fā)酵來擴增質粒DNA，這為將來的產(chǎn)業(yè)化提供了可行性。核酸疫苗的生產(chǎn)涉及多步過程，如發(fā)酵、裂菌、柱層析分離純化目的產(chǎn)物等，在制備過程中采用無菌控制，柱層析時采用注射用水作為流動相，從各個方面來盡量減少樣品的污染。根據(jù)生物制品質量標準，疫苗制品的質量控制多采用生物學分析方法，檢測結

7、果的準確性遠遠大于物理、化學測定方法。本實驗建立了準確、靈敏、簡單易行的疫苗質量檢定分析方法。 在進行動物試驗和臨床試驗前還必須對質粒的含量、純度、殘余雜質進行測定，檢定其是否合格，確定所制備質粒合格才能進行下一步工作。結合本核酸疫苗的發(fā)酵生產(chǎn)及純化制備過程的特點，大腸桿菌是G菌，可以產(chǎn)生內毒素，在破菌過程又會引入宿主核酸及蛋白的污染。因此本研究從內毒素、蛋白殘量、RNA、超螺旋質粒與開環(huán)質粒的比例這幾個方面對疫苗質量進行控制。

8、 第四章白蛋白納米粒-DNA疫苗制備的研究 本實驗探討了治療性乙肝疫苗DNA/AL-NP(DNA/白蛋白納米粒)緩釋系統(tǒng)的制備、性質及其介導DNA體外轉染的效果。采用改進復凝聚法制備白蛋白納米粒，首先分別從乙醇、戊二醛的濃度及固化時間單因素考察對白蛋白納米粒粒徑及分散度的影響，然后采用正交設計考察幾個因素間的交互作用，發(fā)現(xiàn)在較優(yōu)化的條件下制備的納米粒其形態(tài)多為球形，平均粒徑為160nm；從pH值及DNA與白蛋白納米粒的配

9、比考察包封率，使包封率達96％，并在細胞外釋放具有緩釋的特征，且對DNA的結構無影響；DNA/AL-NP緩釋系統(tǒng)能在體外直接轉染HEK293T細胞，并表達出相應的產(chǎn)物，表明對DNA的生物學活性沒有影響，為下一步動物實驗的研究奠定了基礎。 第五章白蛋白納米粒.乙肝DNA疫苗誘導小鼠的細胞免疫的研究 為了進一步證實構建的DNA疫苗的免疫學活性，以及DNA/AL-NP基因疫苗緩釋系統(tǒng)對免疫效果的影響，我們進行了小鼠體內實驗。將