葉酸修飾的蓓薩羅丁白蛋白納米粒給藥系統(tǒng)的研究.pdf

1、蓓薩羅丁(Bexarotene，BEX)是一種新型的維甲酸類藥物，可以選擇性激活維甲酸X受體，調(diào)控基因表達(dá)，具有顯著的抗腫瘤活性。2000年，蓓薩羅丁口服軟膠囊和外用凝膠劑獲美國藥品食品管理局(FDA)批準(zhǔn)上市，主要用于皮膚T-細(xì)胞淋巴瘤的治療。近年來，蓓薩羅丁在肺癌、乳腺癌和卵巢癌等癌癥治療中的應(yīng)用也受到廣泛關(guān)注。但是蓓薩羅丁有一定的毒副作用，水溶性較差，缺乏給藥靶向性，臨床應(yīng)用受到了嚴(yán)重限制。因此，亟需開發(fā)新型有效的給藥系統(tǒng)，增加腫

2、瘤部位的藥物濃度，提高藥物的抗腫瘤療效。
　　白蛋白是一種無毒無免疫原性、生物可降解、生物相容性良好的載體材料，白蛋白納米粒在藥物緩釋靶向系統(tǒng)中應(yīng)用廣泛。葉酸作為一種靶向因子，可以與多種腫瘤細(xì)胞膜（如卵巢癌、結(jié)腸直腸癌、乳腺癌等）表面上的葉酸受體結(jié)合，因此表現(xiàn)出較高的腫瘤細(xì)胞親和力。
　　本課題以蓓薩羅丁為模型藥物，以牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)為載體材料，首先采用去溶劑化法(desolv

3、ation technique)制備了蓓薩羅丁白蛋白納米粒(Bexarotene-loaded bovine serum albumin nanoparticles，BEX-BSANPs)。再利用納米粒表面的活性氨基和葉酸的羧基進(jìn)行酰胺化反應(yīng)，制備了葉酸修飾的蓓薩羅丁白蛋白納米粒(folate-modified bexarotene-loadedbovine serum albumin nanoparticles，F(xiàn)A-BEX-BSAN

4、Ps)，并考察了該給藥系統(tǒng)的構(gòu)建方法、理化性質(zhì)、體外抗腫瘤活性、大鼠體內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)特征等。本研究的主要內(nèi)容包括:
　　1、蓓薩羅丁白蛋白納米粒的處方前研究
　　根據(jù)紫外掃描圖譜確定了BEX的最大吸收波長為260 nm。建立了BEX的高效液相色譜檢測方法:方法學(xué)考察結(jié)果表明其線性關(guān)系在0.25～80.00μg/mL濃度范圍內(nèi)良好，方法的專屬性、日內(nèi)精密度、日間精密度和回收率符合測定要求。采用超速冷凍離心法測定蓓薩羅丁白蛋白納米

5、粒的包封率和載藥量，方法回收率符合要求，操作簡單可行。
　　2、葉酸修飾的蓓薩羅丁白蛋白納米粒的制備研究
　　單因素考察法實(shí)驗(yàn)結(jié)果為:精密稱取一定量的BSA溶于水中，制得BSA水溶液(1.5％，w/v)，調(diào)節(jié)pH至9.0。加入一定量BEX的乙醇溶液，孵育1h后，在25℃恒溫水浴中，500 r/min的恒速攪拌下，以1.5 mL/min的速度滴加一定量的無水乙醇。最后加入戊二醛交聯(lián)固化24 h，在40℃、真空條件下減壓蒸餾除去

6、乙醇。用超速冷凍離心機(jī)離心三次（4℃，20，000 rpm，20 min），所得沉淀用蒸餾水稀釋至原體積即得BEX-BSANPs。酰胺化反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果為:精密稱取一定量的FA溶于二甲基亞砜(DMSO)，加入等量的EDC和NHS（均為葉酸摩爾量的5倍），避光反應(yīng)20 min后，將活化的葉酸(NHS-FA)滴加至BEX-BSANPs溶液(pH=10)中。在恒定轉(zhuǎn)速下室溫反應(yīng)12h。用超速冷凍離心機(jī)離心三次(4℃，20，000 rpm，20 m

7、in)，所得沉淀用蒸餾水稀釋至原體積即得FA-BEX-BSANPs。優(yōu)化工藝操作簡單，所制備的BEX-BSANPs和FA-BEX-BSANPs包封率穩(wěn)定，平均包封率為78.12±0.45％、65.45±0.55％，載藥量為7.96±0.46％、5.36±0.79％。透射電鏡觀察結(jié)果表明所得納米粒為球形，粒徑分布較窄，平均粒徑小于200 nm，Zeta電位分別為-25.51±1.42 mV、-33.64±1.97 mV。葉酸平均偶聯(lián)效率為

8、71.28±1.93μg FA/mgBSA。
　　3、葉酸修飾的蓓薩羅丁白蛋白納米粒凍干工藝研究
　　FA-BEX-BSANPs凍干工藝為:加入5％(w/v)甘露醇作為凍干保護(hù)劑，-80℃下預(yù)凍24 h，將制劑至于真空冷凍干燥機(jī)中凍干48 h。DSC和XRD結(jié)果表明，凍干粉針劑中的BEX以無定形的形式存在，不再是晶體結(jié)構(gòu)，說明BEX完全包裹或吸附于載體材料中，形成了新的物相。將FA-BEX-BSANPs凍干品分別在冷藏(4℃

9、)和室溫(20～25℃)條件下貯存3個(gè)月，其外觀、粒徑、包封率和載藥量等均無較大的改變，表明凍干過程對(duì)FA-BEX-BSANPs的穩(wěn)定性沒有影響。用透析法對(duì)凍干粉針劑的體外釋藥特性進(jìn)行考察，結(jié)果表明在pH7.4的PBS中，F(xiàn)A-BEX-BSANPs具有明顯的藥物緩釋作用，12h累積釋放BEX不到40％，72 h的藥物累積釋放率為76.21±1.65％，96 h基本釋放完全。
　　4、蓓薩羅丁白蛋白納米粒體外抗腫瘤活性評(píng)價(jià)
　

10、　MTT考察結(jié)果表明空白納米粒對(duì)MCF-7細(xì)胞和A549細(xì)胞均無明顯的毒性。BEX原料藥溶液(BEX-SOL)和兩種BEX納米粒對(duì)兩種細(xì)胞均有抑制作用。其中，F(xiàn)A-BEX-BSANPs的抗腫瘤作用最強(qiáng)，且與葉酸受體低表達(dá)的A549細(xì)胞[FR-negative，F(xiàn)R(-)]相比，其對(duì)葉酸受體高表達(dá)的MCF-7細(xì)胞[FR-positive，F(xiàn)R(+)]的抑制作用更顯著。細(xì)胞攝取結(jié)果表明，MCF-7細(xì)胞和A549細(xì)胞對(duì)載香豆素-6納米粒的攝取

11、均強(qiáng)于游離香豆素-6溶液，且MCF-7細(xì)胞[FR(+)]對(duì)葉酸修飾的靶向納米粒的攝取明顯強(qiáng)于普通納米粒。MCF-7細(xì)胞對(duì)靶向納米粒的攝取可被游離的外源性葉酸抑制，而A549細(xì)胞[FR(-)]則不具有上述靶向性特征。由此推斷，靶向納米?？梢越柚[瘤細(xì)胞表面的葉酸受體介導(dǎo)的胞吞作用入胞。
　　5、蓓薩羅丁白蛋白納米粒大鼠體內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)研究
　　以BEX-SOL為對(duì)照，采用HPLC法考察載藥納米粒經(jīng)尾靜脈注射后在大鼠體內(nèi)的藥物動(dòng)力

12、學(xué)行為。數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明，與BEX-SOL相比，制劑組明顯改變了藥物在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)過程，藥物的初始濃度低，血藥濃度-時(shí)間曲線更持久。靜脈注射BEX-BSANPs和FA-BEX-BSANPs后，藥物平均滯留時(shí)間MRT(0-∞)從2.365 h分別延長至6.085 h和6.435 h，藥時(shí)曲線下面積AUC(0-∞)從28.445 mg/L·h分別增大至49.305 mg/L.h和52.527 mg/L·h，清除率CL從0.476 L/h

13、/Kg分別下降至0.283 L/h/Kg和0.267 L/h/Kg。說明經(jīng)靜脈注射給藥后，白蛋白納米?？梢燥@著降低藥物的消除速度，延長其體內(nèi)循環(huán)時(shí)間，有助于藥物緩釋及提高生物利用度。
　　綜上所述，本課題首次成功構(gòu)建了葉酸修飾的蓓薩羅丁白蛋白納米粒雙重靶向給藥系統(tǒng)，利用納米粒的粒徑大小實(shí)現(xiàn)一定的被動(dòng)靶向，利用葉酸受體在多種癌細(xì)胞表面的高表達(dá)性實(shí)現(xiàn)主動(dòng)靶向，將藥物有效地輸送至病變部位。本論文的研究內(nèi)容國內(nèi)外尚未見報(bào)道，為提高難溶性藥