DNA疫苗載體優(yōu)化設(shè)計(jì)和新型佐劑的研究.pdf_第1頁(yè)
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1、DNA疫苗作為一種新型疫苗與傳統(tǒng)疫苗相比有著明顯的優(yōu)勢(shì),同時(shí)能誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫,而且抗原編碼的“裸”DNA具有相對(duì)安全、穩(wěn)定、生產(chǎn)方便和在體內(nèi)能介導(dǎo)抗原的長(zhǎng)期表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)。但是由于免疫原性相對(duì)較弱,目前DNA疫苗的發(fā)展仍然受到很大的限制。 提高抗原基因的表達(dá)對(duì)提高DNA疫苗的免疫原性起到重要的作用,抗原基因的優(yōu)化策略包括:對(duì)質(zhì)粒載體骨架調(diào)控元件的優(yōu)化和利用宿主基因的偏好對(duì)密碼子進(jìn)行優(yōu)化等。目前常利用人巨細(xì)胞病毒(hCMV)第

2、一內(nèi)含子(IntronA)作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件,與hCMV啟動(dòng)子/增強(qiáng)子(Promoter/Enhancer)一同提高缺失內(nèi)含子的目的基因的表達(dá)。有文獻(xiàn)報(bào)道,乙肝病毒(HBV)/旱獺肝炎病毒(WHV)轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件(H/WPRE)、Mason-Pfizer猴病毒(MPMV)組成性轉(zhuǎn)運(yùn)元件(CTE)、單純皰疹病毒胸苷激酶基因(HSV-TK)pre—mRNA加工增強(qiáng)元件(PPE)都能通過提高mRNA的穩(wěn)定性、3’末端的加工、促進(jìn)mRNA出細(xì)胞

3、核和細(xì)胞質(zhì)中mRNA的積累來增強(qiáng)未經(jīng)剪接的基因表達(dá)。但是這類轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件是否能替代hCMVintronA或與其產(chǎn)生協(xié)同作用,從而提高DNA疫苗免疫原性還有待進(jìn)行研究。 本研究首先通過刪除pVR1012質(zhì)粒載體hCMVIE intronA,構(gòu)建內(nèi)含子缺失的質(zhì)粒載體pCMV,然后將HPRE、WPRE、CTE、PPE元件分別克隆入pVR1012和pCMV,獲得了pIn—HPRE、pIn—WPRE、pIn—CTE、pIn-PPE和pH

4、PRE、pWPRE、pCTE、pPPE載體。為比較hCMV IE intronA與HPRE、WPRE、CTE、PPE元件對(duì)目的基因表達(dá)的調(diào)控,將luciferase報(bào)告基因分別克隆入上述載體,體外瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與pVR1012載體相比pIn—HPRE和pIn—WPRE能顯著增強(qiáng)體外luciferase基因的表達(dá),而pHPRE、pWPRE與pVR1012無差別。為比較HPRE、WPRE元件在hCMV IE intro

5、nA存在和缺失的情況下,對(duì)體外抗原基因表達(dá)及體內(nèi)抗原特異的免疫反應(yīng)增強(qiáng)效果的差異,將野生型或密碼子優(yōu)化型的HIV—1B’/C重組亞型CN54株Gag基因克隆入攜帶HPRE、WPRE元件的pVR1012和pCMV的載體,體外瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞和免疫Balb/C小鼠進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,PRE元件能夠顯著地提高野生型Gag基因在293T細(xì)胞中的表達(dá),其中當(dāng)hCMV IE intronA和HPRE元件在載體上同時(shí)出現(xiàn)的時(shí)候基因的表達(dá)水平最

6、高,而且pInHGagw(+intronA/+HPRE)在10μg劑量誘導(dǎo)出的免疫反應(yīng)水平高于pGagw(—intronA/—HPRE)以及pInGagw(+intronA/—HPRE)在40μg劑量所誘導(dǎo)的水平。雖然載體優(yōu)化對(duì)提高體外和體內(nèi)密碼子優(yōu)化型抗原基因表達(dá)作用不太明顯,但研究結(jié)果發(fā)現(xiàn):如果載體經(jīng)hCMVIE intronA和HPRE元件的優(yōu)化,那么即使攜帶野生型基因的載體也能達(dá)到與等量的密碼子優(yōu)化GagDNA疫苗體外抗原基因表

7、達(dá)和體內(nèi)免疫原性相同的水平。 大量的實(shí)驗(yàn)證明佐劑能夠增強(qiáng)DNA疫苗的免疫原性??ń榫募?xì)胞壁骨架由分支菌酸、阿拉伯半乳糖、肽聚糖組成,能激活至少五種Toll樣受體(TLR1、TLR2、TLR4、TLR6和TLR9),同時(shí)BCG中富含有免疫調(diào)節(jié)作用的CpG基序,因此它被認(rèn)為是強(qiáng)有效的非特異免疫刺激劑,并在許多疫苗研究中得以使用??ń槊缍嗵呛怂?BCG-PSN)是經(jīng)熱酚法提取卡介菌多糖核酸制成的免疫調(diào)節(jié)劑,在臨床上已經(jīng)被成功地運(yùn)用于

8、免疫失調(diào)或免疫水平下降及過敏性疾病的治療。本研究選擇卡介苗多糖核酸(BCG-PSN)作為佐劑,評(píng)價(jià)了在不同劑量、不同免疫次數(shù)下BCG-PSN對(duì)pDRVI1.0gp1455M(HIV—1 CN54 gp145基因)DNA疫苗誘導(dǎo)的體液免疫,細(xì)胞免疫以及長(zhǎng)期免疫記憶的增強(qiáng)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,BCG-PSN和DNA疫苗質(zhì)粒混合后注射,能顯著地提高DNA疫苗的免疫原性。并且BCG-PSN的使用能夠減少DNA疫苗的免疫次數(shù),降低DNA疫苗的用量。

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