長鏈非編碼RNA-H19與胃癌相關(guān)成纖維細(xì)胞活化的相關(guān)性研究.pdf

1、目的：
　　對(duì)小鼠胃粘成纖維細(xì)胞（Mouse gastric mucosa fibroblast,MGMF）進(jìn)行原代分離培養(yǎng)，并構(gòu)建其體外活化模型，以模擬體內(nèi)胃癌相關(guān)成纖維細(xì)胞的活化，在此基礎(chǔ)之上探索長鏈非編碼RNA-H19基因(Long non-coding RNA-H19，lncRNA-H19)與胃癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（Gastric cancer-associated fibroblast，GCAF）活化的相關(guān)性。
　　方

2、法：
　　用組織塊法對(duì)小鼠（C57BL/6小鼠）的胃粘膜成纖維細(xì)胞進(jìn)行原代分離培養(yǎng)。成功培養(yǎng)后，在光學(xué)顯微鏡下對(duì)其形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行鑒定，同時(shí)輔以免疫熒光染色鑒定細(xì)胞內(nèi)波形絲蛋白(Vimentin)、結(jié)蛋白(Desmin)的表達(dá)的表達(dá)情況，以進(jìn)一步確認(rèn)其細(xì)胞來源并分析純度;在成功對(duì)小鼠胃粘成纖維細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)后，利用與小鼠胃癌細(xì)胞(MFC)共培養(yǎng)加上間隙性缺氧處理的方法構(gòu)建GCAF的體外活化模型，以模擬胃癌微環(huán)境中GCAF的活化過程

3、。建模后，利用ELISA法對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液中重要的活化效應(yīng)分子進(jìn)行檢測(cè)，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time Quantitative PCR，qPCR)分別對(duì)活化相關(guān)蛋白mRNA進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)利用CCK-8法、Transwell遷移實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞技術(shù)分別對(duì)GCAF體外活化模型進(jìn)行細(xì)胞增殖、遷移及凋亡實(shí)驗(yàn)，并用CCK-8法檢測(cè)MGMF、GCAF分別與MFC共培養(yǎng)后MFC的增殖活力變化，以驗(yàn)證GCAF體外活化模型構(gòu)建是否成功;在成功建模

4、的基礎(chǔ)上，利用qPCR方法對(duì)比分析MGMF及GCAF中l(wèi)ncRNA-H19基因的表達(dá)情況，以驗(yàn)證lncRNA-H19與GCAF的活化有相關(guān)性。同時(shí)，我們進(jìn)一步利用siRNA干擾基因表達(dá)的方法，對(duì)GCAF中的lncRNA-H19基因進(jìn)行干擾沉默，隨后用ELISA法檢測(cè)干擾后相關(guān)活化因子的表達(dá)情況，利用CCK-8法、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞技術(shù)分別對(duì)干擾表達(dá)后的GCAF進(jìn)行細(xì)胞增殖、侵襲及凋亡實(shí)驗(yàn)，以進(jìn)一步證實(shí)lncRNA-H1

5、9與GCAF的活化有明確相關(guān)性。均值的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或方差分析。
　　結(jié)果：
　　光學(xué)顯微鏡下見所分離的細(xì)胞呈梭狀或兩頭尖的長條狀，大小較均一，呈貼壁放射狀生長，符合成纖維細(xì)胞的形態(tài)特征。免疫熒光染色技術(shù)鑒定結(jié)果顯示波形絲蛋白(Vimentin)表達(dá)陽性，而結(jié)蛋白(Desmin)表達(dá)陰性，符合成纖維細(xì)胞的蛋白表達(dá)特征;活化模型建立后，GCAF培養(yǎng)液中重要活化效應(yīng)分子IL-6、TGF-β1、HGF及CXCL12表達(dá)量均

6、較MGMF明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。同時(shí)，GCAF細(xì)胞內(nèi)的α-SMA、FAP相關(guān)mRNA的相對(duì)表達(dá)量也均明顯高于MGMF(P＜0.05)。另外，細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)顯示，GCAF的增殖活性及遷移能力較MGMF明顯增強(qiáng)，而細(xì)胞凋亡明顯降低，且GCAF能明顯促進(jìn)MFC的增殖，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);qPCR法對(duì)細(xì)胞內(nèi)的lncRNA-H19表達(dá)情況檢測(cè)顯示，GCAF的表達(dá)量較MGMF顯著上調(diào)（2.10±0.14VS.1.0

7、0-0.09，P＜0.001）。而lncRNA-H19干擾表達(dá)后，GCAF培養(yǎng)液中前述重要活化效應(yīng)分子的表達(dá)量顯著下降(P＜0.05)，同時(shí)細(xì)胞的增殖活性及侵襲能力也顯著降低，而細(xì)胞凋亡率則顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　LncRNA-H19與GCAF的活化具有明顯的相關(guān)性，抑制LncRNA-H19的表達(dá)可以抑制GCAF的增殖與侵襲，并促進(jìn)其凋亡，這提示LncRNA-H19有可能成為胃癌的臨床