豆豉纖溶酶的純化、特征及其RGDS-載酶脂質納米粒構建與評價.pdf

1、現(xiàn)在心腦血管栓塞性疾病日益嚴重地危害著人們的健康，因此研究開發(fā)低成本、高效、擁有自主知識產權的新一代預防和治療心腦血管栓塞性疾病的功能食品和溶栓劑，具有重大的社會和經濟效益。 本課題研究了中國傳統(tǒng)發(fā)酵食品的纖溶特性，并從中國傳統(tǒng)豆豉中分離、篩選出六株高產纖溶酶的芽孢桿菌，其中以來源于“八寶豆豉”的DC12-33纖溶活力為最高，該菌株被初步鑒定為B.subtilis。DC12-33在48h進入產酶高峰期，通過正交旋轉組合設計擬合D

2、C12-33產纖溶酶與營養(yǎng)因素水平的回歸方程，并通過極值分析優(yōu)化出培養(yǎng)基配方；正交設計試驗優(yōu)化DC12-33產纖溶酶最優(yōu)條件，在此優(yōu)化的條件下其產酶量達到780U/ml(尿激酶單位，纖維蛋白平板法測定)。DC12-33發(fā)酵液經連續(xù)凝膠層析純化，得到電泳純的纖溶酶，其最終純化倍數(shù)和回收率分別達到34.6倍和13.0％，純化酶蛋白比活力達到15494.9U/mg。該酶在還原和非還原條件下SDS-PAGE電泳分析均為單一條帶，且酶的酰胺活力完

3、全被絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF和SBTI所抑制，金屬離子絡合劑EDTA、EGTA以及金屬離子對該酶活力幾乎沒有影響，因此該酶為不含-S-S-的單鏈絲氨酸蛋白酶，我們命名為“FibrinolyticSubtilisinFS33(豆豉纖溶酶)”。SubtilisinFS33的生化特征和酶動力學研究結果表明，該酶在底物特異性、分子量、N-末端序列等多方面都與已知的微生物源纖溶酶不同，因此是一種新型、潛在的溶栓酶。SubtilisinFS33分

4、子量為30KDa，等電點pI為8.7±0.2，且絲氨酸(含羥基)和色氨酸(含吲哚基團)是其酶活性中心或位于酶活性中心附近。FS33在pH7-12的較寬范圍內性質較穩(wěn)定，但酸性條件酶活力迅速下降；SubtilisinFS33對不同的酰胺鍵也表現(xiàn)出不同的活力，其最有效的人工合成底物是N-Succ-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA。該酶的纖溶活力明顯高于傳統(tǒng)的纖溶酶Urokinase和SubtilisinCarlsberg。 通

5、過體外和動物血栓模型體內試驗等，研究評價了SubtilisinFS33對機體凝血系統(tǒng)和纖溶系統(tǒng)的影響及其作用機制。在溶栓機制上，SubtilisinFS33在缺乏內源性溶血因子的情況下，仍能溶解血栓纖維蛋白，表現(xiàn)出直接降解血栓纖維蛋白能力，并且FS33可激活內源性的纖溶酶原，產生活性纖溶酶，因此SubtilisinFS33同時具有直接和間接的溶栓作用。另外，SubtilisinFS33還可降解失活凝血酶和胰激肽釋放原酶等其它重要凝血因子

6、。為提高纖溶酶SubtilisinFS33的生物利用度和組織器官歸巢趨向性，探討了血小板膜纖維蛋白原受體配基RGDS肽作為趨血栓靶向劑的可行性，并構建了SubtilisinFS33RGDS-脂質納米粒載酶系統(tǒng)。硫酸銨梯度法制備的RGDS-載酶脂質體的粒徑在50-150nm左右，屬于納米級單室脂質體，其活性包封率30％左右，其導向物RGDS肽的含量約為93ug/ml。SubtilisinFS33經脂質體包被后其溫度、極端pH和模擬人工腸液