豆豉溶栓酶的表達(dá)、復(fù)性、純化及其藥理學(xué)研究.pdf

1、為了探討豆豉溶栓酶(DouchiFibrinolyticEnzyme，subtilisinDFE)前肽的功能，并在大腸桿菌(Escherichiacoli)中高效表達(dá)豆豉溶栓酶，優(yōu)化豆豉溶栓酶的復(fù)性條件和提高豆豉溶栓酶的純化得率，本研究共構(gòu)建了4種表達(dá)質(zhì)粒。將豆豉溶栓酶全編碼序列(pre-pro-DFE)克隆到pET29a中，表達(dá)產(chǎn)物pre-pro-DFE主要以包涵體形式存在于破菌后的沉淀中，破菌上清中未檢測(cè)到成熟的豆豉溶栓酶，說明pr

2、e-pro-DFE沒有發(fā)生正確的復(fù)性和切割。將豆豉溶栓酶前肽—成熟肽編碼序列(pro-DFE)克隆到pET32a中，豆豉溶栓酶與硫氧還蛋白以Trx-pro-DFE形式融合表達(dá)時(shí)，表達(dá)產(chǎn)物主要以Trx-pro-DFE形式存在于包涵體中，破菌上清中含有成熟的豆豉溶栓酶，有很強(qiáng)的溶栓酶活性。將豆豉溶栓酶成熟肽編碼序列克隆到pET32a中，豆豉溶栓酶與硫氧還蛋白以Trx-DFE形式融合表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物以Trx-DFE形式同時(shí)存在于包涵體和破菌上清

3、中，但破菌上清中未檢測(cè)到成熟的豆豉溶栓酶，也無溶栓酶活性。 通過對(duì)不同緩沖液的透析和用不同緩沖液稀釋進(jìn)行復(fù)性時(shí)發(fā)現(xiàn)，變性的pre-pro-DFE、Trx-pro-DFE及hisTrx-pro-DFE可以通過透析和稀釋復(fù)性，而不含前肽的Trx-DFE則不能，證明前肽對(duì)豆豉溶栓酶的正確折疊與切割是必需的。變性Trx-pro-DFE通過透析或稀釋復(fù)性時(shí)，溶液澄清，復(fù)性效率高，其中透析復(fù)性優(yōu)于稀釋復(fù)性，而透析的優(yōu)選緩沖液為0.5mol/

4、L(NH4)2SO4，20mmol/LTris-HCl(pH8.0)。當(dāng)變性pre-pro-DFE通過透析或稀釋復(fù)性時(shí)，溶液混濁，大部分pre-pro-DFE以沉淀形式析出，復(fù)性效率低。這些結(jié)果說明，硫氧還蛋白可以促進(jìn)豆豉溶栓酶融合蛋白的可溶表達(dá)，在復(fù)性過程中，增強(qiáng)融合蛋白的溶解性，從而協(xié)助豆豉溶栓酶的復(fù)性。前肽能指導(dǎo)豆豉溶栓酶的正確折疊并在折疊完成后從融合蛋白中自動(dòng)切割下來，得到有活性的豆豉溶栓酶成熟肽。前肽對(duì)豆豉溶栓酶的正確折疊與切

5、割是必需的。 由于Trx-pro-DFE含有His-Tag標(biāo)簽，可以通過Ni2+螯和親和層析(IMAC)進(jìn)行在位復(fù)性和純化。通過緩沖液及洗脫條件的優(yōu)化，從IMAC洗脫下來的蛋白己發(fā)生了正確的折疊及切割。該步活性回收率可達(dá)透析復(fù)性的115％。說明IMAC層析復(fù)性效果優(yōu)于透析復(fù)性。另外，作為親和層析的IMAC層析本身具有高效的純化作用，易于放大到工業(yè)化規(guī)模。通過對(duì)Trx-pro-DFE和hisTrx-pro-DFE在IMAC層析柱上

6、的復(fù)性比較可以看出，層析介質(zhì)的表面在一定程度上參與或催化了豆豉溶栓酶的復(fù)性。如果該假設(shè)成立，對(duì)IMAC層析復(fù)性機(jī)理的研究具有十分重要的意義。 將含有和不含前肽的豆豉溶栓酶(pro-DFE和DFE)編碼序列在畢赤酵母(Pichiapastoris)中分別進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，發(fā)現(xiàn)只有含前肽的豆豉溶栓酶基因轉(zhuǎn)化的畢赤酵母工程菌的培養(yǎng)液中可檢測(cè)到較強(qiáng)的溶栓酶活性(130U/mL)；而只含豆豉溶栓酶成熟肽基因轉(zhuǎn)化的畢赤酵母菌的培養(yǎng)液中未檢測(cè)到

7、溶栓酶活性。本研究首次實(shí)現(xiàn)了豆豉溶栓酶在畢赤酵母菌中成功表達(dá)，并直接證明了豆豉溶栓酶的前肽對(duì)其在畢赤酵母中分泌表達(dá)是必需的。 對(duì)大腸桿菌以可溶和包涵體形式表達(dá)的豆豉溶栓酶，以及畢赤酵母菌表達(dá)的豆豉溶栓酶，進(jìn)行了分離純化工藝的研究，并與從解淀粉芽孢桿菌和重組枯草桿菌發(fā)酵液中純化豆豉溶栓酶的工藝進(jìn)行比較，結(jié)果表明，當(dāng)以融合蛋白Trx-pro-DFE形式在E.coli中表達(dá)，從包涵體中純化重組豆豉溶栓酶時(shí)，蛋白回收量和活性回收率都最高

8、。并且該純化方法還具有高效、簡便的特點(diǎn)，是獲得重組豆豉溶栓酶的最佳方法 從1LE.coli發(fā)酵液出發(fā)，通過包涵體制備、變性、IMAC和分子篩層析純化獲得18mg重組豆豉溶栓酶(rDFE)，純度可達(dá)98％以上，活性回收率高達(dá)78％，比活性為4611IU/mg。純化效果非常理想。純化的rDFE經(jīng)分子量、抑制劑作用、最適反應(yīng)溫度、最適反應(yīng)pH、等電點(diǎn)、N末端序列等測(cè)定及免疫印跡分析表明，純化自E.coli的rDFE與來源于解淀粉芽孢桿

9、菌DC-4的天然豆豉溶栓酶(nDFE)具有相同的一級(jí)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和生物學(xué)活性。 對(duì)純化自解淀粉芽孢桿菌的豆豉溶栓酶的急性毒性及藥效學(xué)進(jìn)行了初步研究。結(jié)果表明，小鼠分別尾靜脈注射和口服灌胃豆豉溶栓酶，最大劑量分別為6,500U/kg和3×105U/kg，其活動(dòng)、精神、食欲正常，肛門周圍干燥，一般情況與給藥前相似，10d內(nèi)無一小鼠死亡。所以小鼠靜脈注射和口服灌胃豆豉溶栓酶的LD50分別高于6,500U/kg和3×105U/kg。大

10、鼠連續(xù)灌胃豆豉溶栓酶粉劑60,000U/kg5d后或靜脈注射豆豉溶栓酶針劑1,300U/kg30min后，對(duì)PT、APTT、TT、CT、D-二聚體和血栓形成均有一定的影響。豆豉溶栓酶口服大劑量組60,000U/kg/d和靜脈注射組1,300U/kg/d對(duì)大鼠頸動(dòng)—靜脈搭橋法靜脈血栓形成有一定減少作用，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理后與生理鹽水空白對(duì)照組比較有明顯差異(P＜0.05)。這些結(jié)果顯示，豆豉溶栓酶是安全無毒的，靜脈注射和口服給藥對(duì)大鼠血栓形成有