豆豉纖溶酶的純化、生化特性研究及其體內(nèi)外溶栓效果的評(píng)價(jià).pdf

1、近年來(lái),血栓性疾病的發(fā)病率和死亡率居高不下,已成為嚴(yán)重威脅人類健康的心血管系統(tǒng)疾病。針對(duì)血栓病的治療最有效和常規(guī)的方法是通過(guò)口服或注射纖溶劑來(lái)溶解血栓中的主要蛋白成分-纖維蛋白,從而引起血栓的溶解?，F(xiàn)有溶栓劑存在價(jià)格昂貴、出血風(fēng)險(xiǎn)高、半衰期短、副作用大等問(wèn)題,亟需開發(fā)新的溶栓藥物來(lái)克服這些問(wèn)題。本研究以我國(guó)傳統(tǒng)大豆發(fā)酵食品-豆豉為研究對(duì)象,對(duì)豆豉纖溶酶產(chǎn)生菌的分離鑒定及液體發(fā)酵條件優(yōu)化、豆豉纖溶酶提取純化及基礎(chǔ)生化特性研究、豆豉纖溶酶體

2、內(nèi)外抗栓效果評(píng)價(jià)等內(nèi)容進(jìn)行研究,目的在于從豆豉中分離出纖溶酶產(chǎn)生菌,提取并純化耐熱、耐酸堿、比活性高、特異性高、出血風(fēng)險(xiǎn)小、安全價(jià)廉的纖溶酶,為其開發(fā)成為新一代溶栓藥物提供科學(xué)依據(jù)。
　　第一部分豆豉纖溶酶產(chǎn)生菌的分離鑒定及液體發(fā)酵條件的優(yōu)化
　　目的:從不同豆豉樣品中分離出產(chǎn)纖溶酶的菌株,并篩選出產(chǎn)量最高的一株,鑒定其種屬。對(duì)其優(yōu)化發(fā)酵條件和培養(yǎng)基成分,以獲得最高產(chǎn)酶量。
　　方法:以纖維蛋白平板法初步篩選出產(chǎn)纖溶酶

3、的細(xì)菌,再定量測(cè)定其發(fā)酵液的酶活性,選擇酶活性最大的一株菌進(jìn)行研究。對(duì)該菌株進(jìn)行生理生化及16S rDNA序列研究,確定種屬。以單因素實(shí)驗(yàn)方法篩選出該菌株液體發(fā)酵產(chǎn)酶所需的最佳條件(溫度、初始pH、接種量、裝液量)和最佳碳、氮源。根據(jù)Plackett-Burman設(shè)計(jì)確定影響產(chǎn)酶的關(guān)鍵培養(yǎng)基成分,再采用響應(yīng)面法優(yōu)化各關(guān)鍵成分的比例。最后根據(jù)優(yōu)化結(jié)果擬合出多元回歸方程,計(jì)算最佳培養(yǎng)基組成。按優(yōu)化出的發(fā)酵條件和培養(yǎng)基,繪制該菌株的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶

4、曲線。
　　結(jié)果:篩選到8株產(chǎn)溶栓酶菌株,命名產(chǎn)酶活性最高的一株菌為XY-1,該菌所產(chǎn)纖溶酶命名為豆豉纖溶酶(Douchi Fibrinolytic Enzyme,DFE)。經(jīng)生理生化試驗(yàn)及16SrDNA序列鑒定,確定XY-1為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)。最佳發(fā)酵條件為:溫度40℃、裝液量50ml/250ml、接種量4％、初始pH8.0。最佳碳、氮源為蔗糖和蛋白胨。培養(yǎng)基的最佳組成為:蛋

5、白胨1.14％,蔗糖0.5％,MgSO40.05％,NaCl0.1％。DFE產(chǎn)量的實(shí)際最大值達(dá)到了21.33FU/ml,相當(dāng)于最大預(yù)測(cè)值的107.84％,與未優(yōu)化的培養(yǎng)基相比,增加了79.55％。細(xì)胞外酶活性遠(yuǎn)大于胞內(nèi)酶活。該菌的生長(zhǎng)遲緩期很短,不到4小時(shí),然后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,16小時(shí)后,細(xì)菌生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期。DFE的產(chǎn)量隨著細(xì)菌數(shù)量的增多而增加,在24小時(shí)左右時(shí)達(dá)到最大值。
　　結(jié)論:從豆豉中分離到產(chǎn)纖溶酶的解淀粉芽孢桿菌XY-1

6、(Bacillus amyloliquefaciens),其培養(yǎng)基的最佳組成為:蛋白胨1.14％,蔗糖0.5％,MgSO40.05％,NaCl0.1％,最佳發(fā)酵條件為:溫度40℃、裝液量50ml/250ml、接種量4％、初始pH8.0。DFE的產(chǎn)量在24小時(shí)左右時(shí)達(dá)到最大值。
　　第二部分豆豉纖溶酶的提取、純化及基礎(chǔ)生化特性研究
　　目的:探討從菌株XY-1的發(fā)酵液中提取、純化DFE的方法和條件,并在獲得純品DFE的基礎(chǔ)上,

7、研究該酶的生化特點(diǎn)。
　　方法:發(fā)酵液經(jīng)過(guò)硫酸銨分段鹽析、透析脫鹽后,上SP sepharose fast flow陽(yáng)離子層析柱提取純化,并計(jì)算在此過(guò)程中酶活性和蛋白含量的變化。比較不同pH和溫度對(duì)酶反應(yīng)活性的影響,以及不同pH、溫度、金屬離子和化學(xué)抑制劑對(duì)DFE穩(wěn)定性的影響。比較DFE在含有或不含纖溶酶原平板上的溶圈差異,鑒別其纖溶方式。根據(jù)Lineweaver-Burk法,以纖維蛋白作為底物,測(cè)定DFE的K氏反應(yīng)常數(shù)Km和Vm

8、ax。將DFE純品處理后,經(jīng)HPLC-MS/MS檢測(cè),并將碎片結(jié)構(gòu)與NCBI中非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)的質(zhì)譜信息進(jìn)行比對(duì),鑒定DFE類別。
　　結(jié)果:純化的DFE經(jīng)SDS-PAGE鑒定僅有一條帶,達(dá)到電泳純,分子量為27000Da。DFE被純化了24.3倍,回收率為19.9％,比酶活為2647.3 FU/mg。最佳反應(yīng)pH為9.0,在pH7.0～10.0范圍內(nèi)相當(dāng)穩(wěn)定。DFE在40℃時(shí)活性最強(qiáng),在40℃以下時(shí)活性較穩(wěn)定。Ba2+和Co2

9、+對(duì) DFE活性有明顯促進(jìn)作用,而Pb2+, Fe3+和Hg+會(huì)顯著抑制DFE活性,Ca2+和Cu2+輕微抑制其活性。Na+,K+和Mg2+并未表現(xiàn)出對(duì)DFE有明顯的抑制或促進(jìn)作用。EDTA和PMSF完全抑制該酶活性,而β-巰基乙醇對(duì)其幾乎無(wú)影響。DFE可以直接降解纖維蛋白,而不需要先激活纖溶酶原。Km值為6.98e-08mmol,Vmax為232.5FU。該酶N-末端的15個(gè)氨基酸殘基序列為APALHSQGYTGSNVK,與納豆激酶一

10、致。
　　結(jié)論:經(jīng)一系列提取純化方法獲得DFE純品,該酶是一種絲氨酸蛋白酶,可以耐高溫和耐堿,與纖維蛋白的親和力非常高。
　　第三部分豆豉纖溶酶體內(nèi)外抗栓效果評(píng)價(jià)
　　目的:評(píng)價(jià)DFE的溶栓作用,在體外研究其溶解血凝塊的作用,在體內(nèi)評(píng)價(jià)對(duì)大鼠血栓模型的抗栓效果。
　　方法:將DFE配制成不同濃度的溶液。從大鼠體內(nèi)抽血,自主凝固后形成血凝塊,切成若干份。分別加入高、中、低劑量的DFE溶液、生理鹽水和UK溶液后,37

11、℃孵育16小時(shí),比較反應(yīng)前后血凝塊重量的變化。選取尾長(zhǎng)大于15cm的S-D大鼠,分成DFE高、中、低劑量組,空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和UK組,先經(jīng)一側(cè)尾靜脈注入各受試藥物。30分鐘后,結(jié)扎尾部,經(jīng)另一側(cè)尾靜脈給予1mg/ml的卡拉膠(κ-carrageenan)溶液,立即冰浴1分鐘,20分鐘后除去結(jié)扎。6小時(shí)后,測(cè)量尾部血栓長(zhǎng)度,麻醉大鼠,經(jīng)腹主動(dòng)脈取血,制備血漿,測(cè)量APTT、TT、PT和D-dimer水平。
　　結(jié)果:生理鹽水對(duì)

12、照組,體外血凝塊溶解率只有6.5％,尿激酶組溶解了47.9％的血凝塊,DFE中、高劑量組血凝塊的溶解率明顯升高(59％vs.6.5％,p<0.01;71.7％vs.6.5％,p<0.01),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,并呈劑量-反應(yīng)關(guān)系。與空白組進(jìn)行比較,陰性對(duì)照組大鼠尾部血栓平均長(zhǎng)度為14.19±0.51cm。UK組的大鼠尾部血栓長(zhǎng)度明顯小于陰性對(duì)照組(10.45±3.02cm,p<0.01)。在DFE中(10.25±3.24cm,p<0.05)、

13、高(8.31±3.32cm,p<0.01)劑量組,大鼠尾部血栓長(zhǎng)度均明顯短于生理鹽水對(duì)照組,并呈劑量-反應(yīng)關(guān)系。給藥組的大鼠除了尾部血栓長(zhǎng)度明顯下降外,血栓處的紅腫和炎癥程度也不如陰性對(duì)照組明顯。對(duì)于APTT,僅DFE中劑量組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的增加(p<0.01)。對(duì)于PT,尿激酶組和DFE組均明顯延長(zhǎng),并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)于TT,不同組之間不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。陰性對(duì)照組的D-dimer水平明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)。尿激酶組