瓜蔞(Trichosanthes kirilowii)纖溶酶的分離純化與性質(zhì)分析.pdf

1、血栓性疾病嚴(yán)重危害人類的健康和生命，研制開(kāi)發(fā)特異、高效、安全的溶血栓藥物，成為近年來(lái)生命科學(xué)的熱門(mén)課題之一。研究證明，活血化瘀中草藥可以改善血流動(dòng)力、血流變和微循環(huán)，對(duì)于血栓性疾病有良好的治療效果。本實(shí)驗(yàn)室前期工作表明，中草藥瓜蔞（Trichosanthes kirilowii）具有顯著的體外溶解纖維蛋白的活性，因此，本研究在此基礎(chǔ)上從瓜蔞中分離純化體外具有高纖溶活性的蛋白酶，并對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行研究。
　　 利用硫酸銨沉淀法和等電點(diǎn)

2、沉降法得到瓜蔞蛋白提取物。通過(guò)親和層析（環(huán)氧氯丙烷活化法制備以大豆胰蛋白酶抑制劑為配基的Sepharose4B親和層析載體）、離子交換層析等方法從瓜蔞蛋白提取物中分離得到了兩個(gè)具有纖溶活性、表觀分子量分別為66.0kD和55.6 kD的蛋白酶組分；經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)PVDF膜，對(duì)55.6 kD的蛋白酶N端氨基酸進(jìn)行測(cè)序，得到N端10個(gè)氨基酸序列為N-DVRSPRDTDE，經(jīng)NCBI比對(duì)結(jié)果表明，與其他生物來(lái)源的纖溶酶序列相似性均低3

3、0％，是一種新型纖溶酶，命名為T(mén)kFE。
　　 蛋白酶抑制劑結(jié)果表明該蛋白酶屬于絲氨酸蛋白酶類；它的pI為9.5；相當(dāng)于胰蛋白酶活性為2.47U·mg-1； pH穩(wěn)定性良好，最適pH為9.0；4-40℃保持最高活力，活性穩(wěn)定；Ag+完全抑制TkFE的活性，Cu2+部分抑制TkFE活性，剩余活性為72.25％，Mg2+、Mn2+、Na+、K+對(duì)TkFE的活性均有一定的激活作用；在以酪蛋白為底物的水解反應(yīng)中，溫度、酶底物比、pH、反