低分子肝素聯(lián)合更昔洛韋體外抗人巨細胞病毒的作用.pdf

1、目的:研究低分子肝素(LWMH)聯(lián)合更昔洛韋(GCV)體外抗人巨細胞病毒(HCMV)感染的作用。
　　 方法:
　　 1.測定HCMV AD169對人胚肺成纖維細胞(HELF)的毒力將HCMV病毒懸液用維持液按10倍遞次法稀釋成10-1-10-7的稀釋度,每濃度設8孔。向預先培養(yǎng)成單層的HELF加入各稀釋度的HCMV液,同時設不加病毒的正常HELF對照組,置于37℃、5％CO2恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。逐日觀察細胞特征性病變效應(C

2、PE),記錄細胞的病變孔數(shù),待細胞病變不再進展時,根據(jù)Reed—Muench法計算半數(shù)組織培養(yǎng)感染量(TCID50)。CPE超過50％即(++)以上計為病變孔,(++)以下則計為非病變孔。
　　 2.測定聯(lián)合藥物對HELF細胞的毒性將本實驗小組前期試驗所得GCV和LMWH的各自半數(shù)中毒濃度(TC50)值分別進行倍比稀釋,將兩種藥物均按由高到低濃度互相組合等量混勻,分別加入已長成單層的HELF培養(yǎng)板中,每濃度設4孔,同時設不加藥物

3、的正常HELF對照組。同樣置于37℃、5％CO2恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。每日倒置顯微鏡下觀察記錄聯(lián)合藥物對HELF的病變效應,連續(xù)觀察5～7d待細胞病變不再繼續(xù)時,同時用MTT比色法測定A490值。計算各組細胞存活率(CSR),找出聯(lián)合藥物的TD0,使用Probit回歸法計算出聯(lián)合藥物對HELF細胞TC50。
　　 3.聯(lián)合藥物體外對HCMV增殖的抑制作用固定聯(lián)合藥物中LMWH的最大無毒濃度(TD0)(625mg·L-1),聯(lián)合藥物中GC

4、V濃度為本實驗小組前期測定的其半數(shù)抑制濃度(IC50)始倍比稀釋的濃度,且各濃度均在聯(lián)合藥物中GCV的TD0以下。先用維持液將HCMV稀釋成100TCID50／0.1mL備用。實驗分組為LWMH、GCV(35mg.L-1)、GCV(17.5mg.L-1)、GCV(8.75mg.L-1)、LMWH+GCV(35mg.L-1)、LMWH+GCV(17.5mg.L-1)、LMWH+GCV(8.75mg.L-1)7個不同用藥組以及病毒對照組(V

5、CG)與正常細胞對照組(NCG),各組均設4復孔。各聯(lián)合藥物組與HCMV等量混勻加入已長成單層的細胞,置于37℃、50％CO2恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)2小時,更換維持液,每日倒置顯微鏡下觀察、記錄CPE結(jié)果。待病毒對照組病變達+++～++++時,采用MTT比色法測定A490值。計算各組藥物的病毒抑制率,所得數(shù)據(jù)用金氏公式計算Q值并判斷兩藥的聯(lián)合效應。同時運用熒光定量聚合酶鏈反應(FQ-PCR)法檢測聯(lián)合藥物干預后各組HELF細胞HCMV的病毒載量,

6、計算各組藥物對HCMV DNA的抑制率。
　　 結(jié)果:
　　 1.將病毒原液行連續(xù)10倍遞次稀釋后,本實驗測得HCMV AD169病毒株的TCID50=10-4.62／0.1mL。
　　 2.用MTT比色法測定聯(lián)合藥物對HELF細胞的TC50的劑量LMWH為943.6mg.L-1,GCV為567mg.L-1。聯(lián)合藥物TD0中LMWH的濃度是625mg.L-1,GCV的濃度為375mg.L-1。且聯(lián)合用藥對細胞的毒

7、性試驗結(jié)果及顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化顯示隨著聯(lián)合用藥中二者藥物濃度的下降,細胞存活率升高,藥物對細胞的毒性作用減弱。
　　 3.當HCMV AD169株濃度為100TCID50感染HELF時,LMWH和GCV均不同程度提高受染細胞的存活率,降低受染細胞的HCMVDNA的拷貝數(shù)。
　　 4.當固定LMWH最大無毒濃度,與GCV的3種不同濃度配伍時,結(jié)果均在HELF細胞上有明顯的抗HCMV的生物活性,并顯示配伍后的抑制作用明