人巨細(xì)胞病毒誘導(dǎo)CHRF-288-11細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制.pdf

1、本研究在原有的工作基礎(chǔ)上，將進(jìn)一步對(duì)HCMV引起血小板減少癥的分子機(jī)制進(jìn)行闡明。 研究材料：材料CHRF-288-11細(xì)胞株由香港中文大學(xué)兒科系實(shí)驗(yàn)室提供。HCMVAD169株由中國武漢病毒研究所提供，效價(jià)為10-6TCD50/ml。批號(hào)為20040625。 研究方法：CHRF-288-11細(xì)胞株用含10％FBS、100單位/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的MeM培養(yǎng)液，在37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)，每周換液2次，

2、傳代1次。取對(duì)數(shù)增殖期細(xì)胞作實(shí)驗(yàn)。HCMV原液直接感染CHRF細(xì)胞株。使其終濃度分別為原液的1/10000即10-4、1/1000即10-3、3/1000即3×10-3和1/100即10-2，并設(shè)立空白對(duì)照組。用RT-PCR觀察鑒定HCMV是否能直接感染CHRF細(xì)胞株；用MTT法檢測各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞存活率；用Hoechst核染色、DNA片段瓊脂糖凝膠電泳、流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞亞二倍體峰等進(jìn)行分析HCMV感染CHRF細(xì)胞株后誘導(dǎo)凋亡的特征；用

3、Western-Blotting免疫印跡和各種特異性的阻斷劑分析HCMV介導(dǎo)凋亡的信號(hào)機(jī)制。 研究結(jié)果： 1.HCMV能直接感染CHRF細(xì)胞RT-PCR擴(kuò)增特異IE基因，擴(kuò)增產(chǎn)物在2％的瓊脂糖凝膠中電泳，通過紫外凝膠成像，各HCMV感染組均可見一條特異性擴(kuò)增條帶，而空白對(duì)照組未見陽性條帶。 2.HCMV誘導(dǎo)CHRF細(xì)胞生長抑制和凋亡體外培養(yǎng)CHRF細(xì)胞經(jīng)10-2HCMV直接感染后，用MTT，PI單染流式細(xì)胞，Ho

4、echst33258核染色等方法于HCMV感染后的第2天、第4天和第6天分別檢測。 檢測結(jié)果表明：感染后時(shí)間依賴性地細(xì)胞存活率顯著降低，G1期前的亞二倍體峰(凋亡率)顯著增加，細(xì)胞核固縮核碎裂現(xiàn)象增加。在相同培養(yǎng)條件下，用10-4、10-3和10-2濃度的HCMV感染CHRF細(xì)胞，于感染后第4天用MTT，PI單染流式細(xì)胞，Hoechst33258核染色和DNA凝膠電泳等法檢測。檢測結(jié)果表明：HCMV濃度依賴性地降低CHRF細(xì)胞存

5、活率，增加CHRF細(xì)胞的凋亡率，誘導(dǎo)CHRF細(xì)胞核固縮核碎裂增加，DNA梯樣條帶。 3.Caspase-3的激活參與HCMVAD169株誘導(dǎo)的CHRF細(xì)胞凋亡CHRF感染組CHRF細(xì)胞內(nèi)總caspase-3(35kd)量逐漸減少，而活化態(tài)的caspase-3片段(19或17KD)顯著增加。Caspase-3特異抑制劑Z-VAD-FMK在HCMV感染CHRF細(xì)胞后12h加入處理組，于感染后第4天用MTT法檢測細(xì)胞存活率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)c

6、aspase-3特異抑制劑Z-VAD-FMK抑制HCMV降低的CHRF細(xì)胞存活率。 4.抑制ERK通路介導(dǎo)HCMV抑制CHRF細(xì)胞的增殖用10-2HCMV感染CHRF細(xì)胞，于指定的時(shí)間收集各時(shí)間點(diǎn)的蛋白，用Westernblotting檢測，結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組相比，HCMV處理組隨著感染時(shí)間延長ERK1/2磷酸化水平逐漸降低；用ERK通路的特異抑制劑PD98059加入CHRF細(xì)胞，顯示其可抑制ERK1/2磷酸化水平；該過程中

7、ERK1/2蛋白總量不變。同時(shí)，PD98059可降低CHRF細(xì)胞存活率。 5.激活c-Jun通路介導(dǎo)HCMV誘導(dǎo)的CHRF細(xì)胞的凋亡用10-2HCMV感染CHRF細(xì)胞后，于指定的時(shí)間收集各時(shí)間點(diǎn)的蛋白，用Westernblotting檢測，結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組相比，HCMV感染組隨著感染時(shí)間延長CHRF細(xì)胞內(nèi)p-c-Jun和c-Jun逐漸增加；用JNK特異抑制劑SP600125可抑制HCMV增加的p-c-Jun和c-Jun蛋白

8、水平。同時(shí)，SP600125抑制HCMV降低的CHRF細(xì)胞存活率。 研究結(jié)論： 1.HCMVAD169株直接感染CHRF細(xì)胞并降低其存活率。 2.HCMVAD169株可以誘導(dǎo)典型的CHRF細(xì)胞的凋亡。 3.Caspase-3的激活參與HCMVAD169株誘導(dǎo)的CHRF細(xì)胞凋亡。 4.HCMV抑制ERK通路的活性可能是其抑制CHRF細(xì)胞增殖的主要分子基礎(chǔ)。 5.激活c-Jun通路的活性可能是