轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在先天性脊椎裂胎鼠中的分布和分化.pdf

1、目的：
　　 神經(jīng)管發(fā)育畸形是除心臟畸形以外的最常見的先天性畸形之一,世界范圍內(nèi)占出生嬰兒總數(shù)的1/1000-9/1000。神經(jīng)管畸形是由于胚胎發(fā)育早期神經(jīng)褶的融合異常所致,以脊椎裂最為常見。先天性脊椎裂常發(fā)生在腰骶部,多伴有嚴(yán)重的尿、便失禁和下肢活動(dòng)障礙。研究發(fā)現(xiàn),先天性脊椎裂鼠支配肛門外括約肌和肛提肌的脊髓運(yùn)動(dòng)和感覺神經(jīng)元數(shù)量明顯減少。因此利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)在體內(nèi)具有向神經(jīng)細(xì)胞分化的潛能,進(jìn)行神經(jīng)元的修復(fù)或替代治

2、療為該病提供了一個(gè)新的治療思路。
　　 MSC是一種具有自我增殖和多向分化潛能的成體干細(xì)胞,它遺傳背景穩(wěn)定,可在體外培養(yǎng)、擴(kuò)增及誘導(dǎo)。目前,它已被分化誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肌細(xì)胞等多種細(xì)胞,是組織工程中具有廣闊前景的一類種子細(xì)胞。利用MSC進(jìn)行細(xì)胞學(xué)和組織工程學(xué)研究,有以下優(yōu)點(diǎn):①取材方便;②可在培養(yǎng)基中快速擴(kuò)增;③MSC經(jīng)誘導(dǎo)分化后進(jìn)行自體移植,不存在免疫反應(yīng),而且避免了社會(huì)倫理問題;④在宿主組織中可長

3、期生存并分化;⑤可表達(dá)導(dǎo)入的外源基因。因此,MSC是一種理想的細(xì)胞來源,為疾病的細(xì)胞治療和基因治療帶來了新的希望。
　　 本實(shí)驗(yàn)對(duì)骨髓MSC進(jìn)行體外培養(yǎng)、擴(kuò)增,用帶有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)的腺病毒轉(zhuǎn)染,并建立先天性脊椎裂胎鼠模型,將轉(zhuǎn)染的MSC移植入胎鼠體內(nèi),觀察MSC在胎鼠脊髓中的存活、分布及分化情況,為臨床治療提供理論基礎(chǔ)。
　　 材料和方法：
　　 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
　　 (1)原代培養(yǎng)

4、　　 普通級(jí)4周齡Wistar鼠40只,雌雄不限,體重90-100g。由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
　　 (2)動(dòng)物模型
　　 普通級(jí)孕10天Wistar鼠61只,分為致畸組41只(孕17天21只,孕18天20只)和對(duì)照組20只。
　　 2、方法
　　 (1)原代培養(yǎng)
　　 無菌條件下取大鼠骨髓用貼壁培養(yǎng)法進(jìn)行原代培養(yǎng),0.4％臺(tái)盼蘭染色測定細(xì)胞活力,流式細(xì)胞儀進(jìn)行CD34、CD

5、44和CD90表型鑒定。
　　 (2)轉(zhuǎn)染
　　 腺病毒-EGFP(MOI值300-500)轉(zhuǎn)染P2或P3代骨髓MSC,流式細(xì)胞儀鑒定MSC的轉(zhuǎn)染率。
　　 (3)建立胎鼠先天性脊椎裂動(dòng)物模型
　　 致畸組孕10天予4％維甲酸(140mg/kg)胃管給藥,對(duì)照組予等量橄欖油。孕17天或18天時(shí),觀察胎鼠外觀并記錄顯性脊椎裂等先天畸形的發(fā)生率,進(jìn)行細(xì)胞移植。
　　 (4)細(xì)胞移植
　　 將轉(zhuǎn)

6、染EGFP的MSC經(jīng)纖細(xì)玻璃針注射到先天性脊椎裂胎鼠的脊髓中,修復(fù)孕鼠子宮、關(guān)腹,孕鼠繼續(xù)飼養(yǎng)至20天。
　　 (5)移植細(xì)胞的存活及分布情況
　　 取20天先天性脊椎裂胎鼠的脊椎,固定脫水后做連續(xù)冰凍切片,計(jì)數(shù)脊髓中綠色熒光細(xì)胞數(shù)。
　　 (6)移植細(xì)胞的分化
　　 免疫熒光方法檢測EGFP陽性MSC中巢蛋白(nestin)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)的分布與表達(dá)。

7、r>　　 結(jié)果：
　　 1、骨髓MSC原代培養(yǎng)5.7天可傳代,0.4％臺(tái)盼蘭染色細(xì)胞活力為97％-98％。傳代后細(xì)胞增殖加快,4.5天可傳代。MSC每傳一代細(xì)胞數(shù)增加3-4倍。
　　 2、流式細(xì)胞儀鑒定結(jié)果顯示MSC不表達(dá)CD34,87％表達(dá)CD44,98％表達(dá)CD90。
　　 3、腺病毒-EGFP轉(zhuǎn)染骨髓MSC的轉(zhuǎn)染率為40％。
　　 4、致畸組共獲得胎鼠253只,先天性顯性脊椎裂胎鼠163只,致畸率

8、64.4％。對(duì)照組未見畸形胎鼠。
　　 5、細(xì)胞移植后,共獲得先天性顯性脊椎裂鼠脊髓83個(gè),其中帶有EGFP-MSC陽性脊髓27個(gè)。每個(gè)脊髓中EGFP陽性細(xì)胞數(shù)多少不等,66-735個(gè)。孕17天或孕18天進(jìn)行細(xì)胞移植,脊髓內(nèi)存活MSC數(shù)量在兩組之間無顯著性差異(P＞0.05)。移植的MSC存在于脊髓表面或進(jìn)入脊髓中,可分化為不同形狀的細(xì)胞。
　　 6、免疫熒光法證實(shí)移植到脊髓中的MSC可表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)志物nestin

9、和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物GFAP。
　　 結(jié)論：
　　 1、貼壁培養(yǎng)法是分離骨髓MSC的簡單易行方法,傳代后細(xì)胞增殖迅速,純度高,可滿足實(shí)驗(yàn)需要。
　　 2、腺病毒載體介導(dǎo)EGFP基因?qū)τ贛SC具有較高的轉(zhuǎn)染率,不影響細(xì)胞的存活與分化,是研究MSC移植的理想示蹤方法。
　　 3、過量維甲酸可以建立穩(wěn)定的先天性顯性脊椎裂動(dòng)物模型。
　　 4、帶有EGFP的MSC經(jīng)細(xì)胞移植后能在胎鼠脊髓內(nèi)存活,并可以分