胞外鈣離子對豬BMSCs增殖和成脂分化的影響及作用機制.pdf

1、骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）是一種多能干細胞，可向肌細胞和脂肪細胞分化，從而影響動物體內(nèi)肌肉和脂肪的組成。因此，研究BMSCs的增殖和成脂分化對于調(diào)控動物不同部位脂肪沉積、提高肉品質(zhì)具有重要的意義。Ca2+是普遍存在于細胞內(nèi)的重要信號物質(zhì)，對細胞的增殖和脂肪生成具有重要的調(diào)控作用。然而，胞外鈣離子（[Ca2+]o）對豬骨髓間充質(zhì)干細胞（pBMSCs）增殖和成脂分化的影響及其作用機制還不清楚。首先，采用熒光定量 PCR技術(shù)檢測了[Ca2

2、+]o對pBMSCs成脂分化過程中不同時間細胞膜上鈣離子通道，包括L型電壓門控鈣通道（L-VGCC）亞型α/δ1（CACNA2D1）、鈣釋放激活鈣通道調(diào)控分子1（Orai1）、瞬時受體電位通道香草素受體亞型1（TRPV1），以及鈣敏感受體（CaSR）基因mRNA表達的影響。其次，采用CCK-8試劑盒、流式細胞分析、熒光定量PCR及Western blot等方法分別檢測了[Ca2+]o和/或nifedipine（L-VGCC阻斷劑）、NP

3、S2143（CaSR阻斷劑）、U0126（ERK通路阻斷劑）對pBMSCs增殖過程中的細胞數(shù)目、細胞周期分布、胞內(nèi)鈣離子（[Ca2+]i）濃度以及增殖相關(guān)基因、CaSR和ERK表達的影響，揭示了[Ca2+]o對 pBMSCs增殖的影響及作用機制。最后，我們研究了[Ca2+]o對 pBMSCs成脂分化和葡萄糖吸收的影響及其信號通路。采用油紅 O染色、TG濃度檢測研究了[Ca2+]o和/或nifedipine、NPS2143、BAPTA-A

4、M（[Ca2+]i螯合劑）、KN-93（CaMKII阻斷劑）、Wortmannin（PI3K通路阻斷劑）對pBMSCs成脂分化10天細胞聚酯的影響；通過Western blot進一步研究了[Ca2+]o和各阻斷劑對pBMSCs成脂相關(guān)基因（PPARγ、CEBPα、aP2）、CaMKII、PI3K/Akt及其下游FoxO1和AS160表達的影響。此外，我們還通過葡萄糖檢測試劑盒、2-NBDG熒光葡萄糖吸收試劑盒、Western blot等

5、方法研究了[Ca2+]o對pBMSCs成脂過程中葡萄糖消耗及吸收、葡萄糖轉(zhuǎn)運體4（GLUT4）表達與轉(zhuǎn)位的影響及調(diào)控機制。
　　研究結(jié)果如下：
　　1、在pBMSCs成脂分化第5天，4 mM[Ca2+]o極顯著促進細胞膜上鈣離子通道（CACN2D1、Orai1、TRPV1）以及CaSR基因的mRNA表達，提示[Ca2+]o及相關(guān)的細胞膜上的鈣離子通道、CaSR可能在pBMSCs成脂分化的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。
　　2、[

6、Ca2+]o劑量依賴性促進pBMSCs增殖，且[Ca2+]o顯著促進pBMSCs增殖過程中CaSR的mRNA和蛋白表達；[Ca2+]o能夠升高pBMSCs增殖過程中[Ca2+]i濃度，促進pBMSCs增殖過程中S期的細胞分布比例和細胞增殖指數(shù)（PI），同時抑制G0/G1期細胞分布比例；[Ca2+]o能夠促進 pBMSCs促增殖相關(guān)基因（cyclinA2/D1/D3/E2、PCNA）的mRNA和/或蛋白表達，同時抑制p21基因的mRNA和

7、蛋白表達；此外，[Ca2+]o能夠促進pBMSCs增殖過程中ERK1/2蛋白磷酸化；而阻斷CaSR或抑制ERK1/2信號通路均能夠逆轉(zhuǎn)[Ca2+]o促進pBMSCs增殖及ERK通路激活的效果。以上結(jié)果提示，[Ca2+]o通過激活細胞膜上CaSR，提高胞內(nèi)鈣離子濃度，激活胞內(nèi)ERK信號通路，進而促進pBMSCs的增殖。
　　3、[Ca2+]o顯著升高pBMSCs成脂過程中[Ca2+]i的濃度，促進胞內(nèi)TG含量及成脂相關(guān)基因PPARγ

8、、CEBPα、aP2的蛋白表達；抑制VGCC和CaSR可阻斷[Ca2+]o對[Ca2+]i的升高作用；同時，[Ca2+]o顯著促進CaMKII、PI3K/Akt及其下游FoxO1的磷酸化；nifedipine、NPS2143、BAPTA-AM、KN-93、Wortmannin均能夠逆轉(zhuǎn)[Ca2+]o對pBMSCs成脂分化以及CaMKII、PI3K/Akt和FoxO1磷酸化的促進作用。以上結(jié)果提示，[Ca2+]o通過VGCC和CaSR促進

9、[Ca2+]i的升高，進而激活CaMKII-PI3K/Akt-FoxO1通路，從而促進pBMSCs的成脂分化。
　　4、[Ca2+]o顯著促進細胞GLUT4的表達和轉(zhuǎn)位、加強細胞的葡萄糖消耗和吸收，同時促進細胞CaMKII、PI3K/Akt和AS160的磷酸化；而nifedipine、BAPTA-AM、KN-93、Wortmannin均能逆轉(zhuǎn)[Ca2+]o對pBMSCs成脂過程中GLUT4表達及轉(zhuǎn)位、葡萄糖吸收與消耗的促進作用。上

10、述結(jié)果提示，[Ca2+]o通過VGCC促進[Ca2+]i的升高，進而激活CaMKII-PI3K/Akt-AS160通路，從而促進pBMSCs成脂過程中GLUT4的轉(zhuǎn)位及葡萄糖的吸收。
　　綜上，[Ca2+]o顯著促進pBMSCs成脂過程中細胞膜鈣離子通道及CaSR的表達；[Ca2+]o通過激活pBMSCs細胞膜上的CaSR使[Ca2+]i濃度升高，進而激活胞內(nèi)ERK通路，促進細胞周期進程與細胞的增殖；在pBMSCs成脂分化中，[C